骨发育相关基因在SEDT中差异表达的研究

作者：胡玉娟; 熊丰; 朱高慧; 罗庆; 朱岷

来源：重庆医科大学学报, 2016, 41(02): 118-123.

DOI：10.13406/j.cnki.cyxb.000743

• X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良
• 基因芯片
• 基因重组病毒

目的:分别靶向增强和干扰人软骨细胞(human chondrocytes-articular,HC-a)X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(Xlinked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)基因,骨再生PCR芯片检测细胞内骨发育相关基因表达变化,观察干扰后基因表达谱的变化。方法:分别转入前期构建的靶向增强SEDL的腺病毒质粒p Ad5-SEDL和靶向干扰SEDL的慢病毒质粒LVsi SEDL到293T细胞包装成重组腺病毒p Ad5-SEDL和重组慢病毒LV-si SEDL,扩增重组腺病毒,收集病毒液,检测病毒滴度。将重组腺病毒、重组慢病毒以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别感染HC-a,实验分4组:增强组(HC-a/p Ad5-SEDL,重组腺病毒p Ad5-SEDL感染HC-a增强SEDL基因表达)、增强阴性对照组(HC-a/空载体(p Ad5),空白腺病毒p Ad5感染HC-a作阴性对照)、干扰组(HC-a/LV-si SEDL,重组慢病毒LV-si SEDL感染HC-a干扰SEDL基因表达)、干扰阴性对照组(HC-a/空载体(LV),空白慢病毒LV感染HC-a作阴性对照),通过QPCR检测HC-a中SEDL基因表达、Western blot检测HC-a中sedlin蛋白表达,验证是否成功干扰或增强SEDL基因表达,收集4组细胞m RNA进行骨再生PCR芯片(含84个基因)检测。结果:(1)收获高滴度重组腺病毒p Ad5-SEDL,病毒滴度为2.6×1011 pfu/ml。并使重组腺病毒p Ad5-SEDL和重组慢病毒LV-si SEDL成功感染HC-a。(2)HC-a SEDL基因表达量中增强组(2.14±0.36)较增强阴性对照组(1.21±0.25)增高(P=0.022),干扰组(0.86±0.11)较干扰阴性对照组(1.34±0.06)降低(P=0.003);sedlin蛋白表达量中,增强组(0.56±0.04)较增强阴性对照组(0.37±0.05)增高(P=0.006),干扰组(0.13±0.02)较干扰阴性对照组(0.36±0.04)降低(P=0.001)。(3)基因芯片结果:HC-a内SEDL基因干扰后,芯片结果显示:基因上调21个,下调5个。HC-a内SEDL基因增强后,骨再生PCR芯片结果显示:基因上调27个,下调12个。干扰组的差异表达基因中,在增强组中呈反向变化,且与软骨发育相关的基因有5个:COL2A、BMP3、FLT1、GDF10、IGF1。结论:通过增强及沉默软骨细胞内SEDL基因,发现骨发育相关基因中COL2A、BMP3、FLT1、GDF10、IGF1出现差异表达,可能与SEDL基因有关联。

• 单位
  重庆医科大学附属儿童医院