嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞体外培养体系及慢病毒侵染条件的优化

作者：王红霞; 潘俊斐; 蒋丹; 屈昱良; 李艳宁; 李光琪; 楚元奎; 张晓春; 徐广贤^*

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2020, 36(05): 390-397.

DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.009012

• 增殖
• 活化
• 脐带血
• 嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞

目的优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件。方法 CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细胞介素2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-18、rhIL-7、 rhIL-21、 TWS119。分别于第0、 3、 5、 7、 10、 18天进行细胞计数检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达, ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)释放,优化T细胞体外培养体系。采用(0、 20、 50)μg/mL重组人纤连蛋白(RetroNectin?),(250、 500、 1000)ng/mL抗人CD3/CD28抗体包被培养板,以感染复数(MOI)=3、 5的阴性对照慢病毒侵染T细胞72 h,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,初步判断病毒侵染效率;流式细胞术检测CD3/GFP阳性率,以获得慢病毒侵染条件。包装CD19 CAR慢病毒,实时荧光定量PCR、 Western blot法检测是否成功构建CD19 CAR慢病毒载体,采用以上优化的病毒侵染条件及T细胞培养体系,包括建立rhIL-2、 rhIL-12联合rhIL-18培养体系,使用1μg/mL抗人CD3/CD28, 20μg/mLRetroNectin?包被培养板,制备CD19 CAR-T细胞。结果细胞增殖能力较佳体系为rhIL-2联合rhIL-18, IFN-γ释放最强体系为rhIL-2、 rhIL-12联合rhIL-18。抗CD3/CD28抗体剂量为1μg/mL, RetroNectin?20μg/mL, MOI为3时病毒侵染效率最优。该优化条件下CAR-T细胞阳性率达34%。结论获得优化的CD19 CAR-T细胞体外培养体系及慢病毒侵染原代T细胞条件。

• 单位
  宁夏医科大学; 宁夏医科大学总医院