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摘要
利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫泛素特异性蛋白酶TgUSP10的内源性标记虫株，经单克隆后通过PCR和Western blot对内源性标记虫株进行鉴定，并通过间接免疫荧光试验分析了TgUSP10蛋白的亚细胞定位与表达水平；同时，构建TgUSP10敲除虫株，经单克隆后进行PCR鉴定，并通过噬斑、黏附/入侵、复制和逸出试验评估TgUSP10缺失对弓形虫体外增殖的影响。IFA结果显示，TgUSP10定位于细胞质，并在G1期、S期和分裂后期表达量较高；成功构建了TgUSP10敲除虫株，与RH△ku80虫株相比，TgUSP10敲除虫株形成噬斑的能力显著减弱；进一步分析体外增殖的具体过程后发现，TgUSP10敲除虫株的复制能力显著减弱，而黏附/入侵和逸出能力没有显著变化。结果表明，成功构建了TgUSP10的内源性标记虫株，TgUSP10定位于虫体细胞质，并对弓形虫体外增殖具有重要作用，为后续进一步阐明其功能和作用机制奠定基础。
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