菘蓝木脂素糖基转移酶体外催化根皮素的酶学研究

作者：姜银银; 谭宇萍; 孙术富; 杨健; 郭娟; 唐金富^*

来源：中国中药杂志, 2022, 47(15): 4074-4083.

DOI：10.19540/j.cnki.cjcmm.20220509.101

• 菘蓝
• 糖基转移酶
• 根皮素
• 酶学性质分析
• 分子对接
• 突变

体外酶促反应发现前期克隆的菘蓝木脂素糖基转移酶UGT236(属于UGT71B家族)能高效催化根皮素生成根皮苷。UGT236与苹果中的P2′GT同源性较高，同属UGT71家族。该研究将重组质粒pET-28a-MBP-UGT236转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达，并通过纯化获得较高纯度的UGT236蛋白，以根皮素为底物，研究其酶学性质。结果显示，UGT236最适反应温度为40℃,最适反应pH为8(Na2HPO4-NaH2PO4体系)。金属离子影响实验表明，Ni2+、Al3+对UGT236有一定抑制作用，Fe2+、Co2+、Mn2+ 3种离子均能提高UGT236的活性，而Mg2+、Ca2+、Li+、Na+、K+对UGT236的活性没有影响。酶动力参数实验测得根皮素的Km为61.03μmol·L-1,Kcat为0.01 s-1,Kcat/Km为157.11 mol-1·s-1·L,UDPG的Km为183.6μmol·L-1,Kcat为0.01 s-1,Kcat/Km为51.91 mol-1·s-1·L。通过同源建模、分子对接筛选出部分可能的活性位点，对其进行突变及活性检测鉴定了3个关键的活性位点Glu391、His15、Thr141,而位点Phe146则和产物的多样性有关。该研究发现菘蓝中木脂素类糖基转移酶UGT236能催化根皮素生成根皮苷，对其酶学性质进行了探究，通过结构预测、分子对接和突变验证发现了几个关键的氨基酸残基，为根皮素糖苷产物的专一性和多样性催化提供了一定依据，可为后续通过改造获得高效和专一性催化的人工糖基转移酶元件提供参考。

• 单位
  道地药材国家重点实验室; 中国中医科学院