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摘要
目的制备能与肾癌相关抗原G250胞外区特异性结合的纳米抗体。方法通过瞬时转染方式将包含G250蛋白胞外区基因片段的质粒导入到真核细胞HEK 293F中表达G250胞外区,以该重组蛋白免疫新疆双峰驼,构建噬菌体展示纳米抗体库。通过体外定向筛选,得到能与G250蛋白胞外区特异性结合的噬菌体,以Monoclonal phage ELISA方法筛选出具有结合活性的噬菌体克隆。通过细胞ELISA和流式细胞仪再次验证淘选到的纳米抗体的细胞结合活性。结果测序证明编码G250的重组DNA片段序列正确,Western blot检测结果证实G250重组蛋白成功表达。通过免疫新疆双峰驼,成功构建了库容为2.87×109的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库。在体外对免疫纳米抗体库进行3轮固相筛选,使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集,阳性率高达54.3%。经过抗原ELISA、细胞ELISA鉴定,筛选出3个具有细胞结合活性的纳米抗体噬菌体克隆,取其中结合活性最高的Nb-G5进行表达、纯化,产量为1.5 mg/L培养物,流式细胞仪检测结果证实Nb-G5与G250表达阳性的细胞具有很强的特异性结合能力。结论从纳米抗体库中淘选得到了在分子和细胞水平均能与G250蛋白胞外区特异性结合的纳米抗体。
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单位淡水生态与生物技术国家重点实验室; 中国科学院水生生物研究所; 第三军医大学西南医院
