汉城病毒L99株双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立及应用

作者：孙晨; 唐剑光; 孙宏亮; 李景良; 常军亮; 顾建阳^*

来源：中华微生物学和免疫学杂志, 2022, 42(03).

• 汉城病毒
• 单克隆抗体
• 双抗体夹心ELISA
• 抗原检测

目的建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法, 验证其检测性能, 为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水, Protein-A亲和层析纯化腹水抗体, SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度, 间接ELISA法测定McAb效价, Western blot鉴定其特异性;叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后, 通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度, 建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准, 验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度;通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果 4株McAb腹水效价均>1∶106, 抗体纯度均>98%;经Western blot鉴定, 1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白, 2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应;经抗体配对筛选后, 选择3A4为包被抗体, 1D5为标记抗体;棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml, HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml;线性范围为0.078 1～2.500 0 μg/ml, R2>0.99;专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性;抗原回收率在95.8%～108.7%之间, 精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。结论成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法, 为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中, SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。

• 单位
  长春生物制品研究所