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摘要
为了建立一种灵敏度更高的蜜蜂残翅病毒两步法荧光定量PCR检测方法，根据残翅病毒保守基因片段设计引物，采取反转录过程与荧光定量PCR过程分步进行的方式，建立基于SYBR染料法检测残翅病毒的两步法实时荧光定量PCR检测方法，并对其特异性、灵敏性、稳定性和可行性进行验证。结果显示，建立的两步法荧光定量PCR检测方法采用的引物特异性良好，在6.58×101～6.58×108拷贝/μL质粒标准品间具有良好线性关系，R2为0.999 7，扩增效率为100.8%。该方法的灵敏度为6.58拷贝/μL，与蜜蜂黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应，组内变异系数为0.20%～0.66%，组间变异系数为0.08%～0.98%，对蜜蜂样品残翅病毒的阳性检出率明显高于普通PCR，具有良好的特异性、重复性和实用性。综上，成功建立了一种灵敏度高、适用性好的残翅病毒两步法实时荧光定量PCR检测方法，为我国蜜蜂残翅病的流行病学调查、疫情监测和预警机制的构建提供新的技术支持。
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