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摘要
【目的】制备红嘴鸥Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)蛋白多克隆抗体，分析红嘴鸥TLR7蛋白在DF-1细胞中的表达特征，为深入了解红嘴鸥TLR7蛋白功能及作用机制提供材料。【方法】设计引物扩增红嘴鸥TLR7基因CDS区，并构建其原核表达载体与真核表达载体。将重组原核表达质粒pET32a-TLR7转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞进行重组蛋白体外诱导表达，并对其诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化筛选。选用新西兰大白兔制备多克隆抗体，采用间接ELISA法检测血清抗体价效，利用Western blotting鉴定抗体特异性。将真核表达质粒pcDNA3.1-TLR7转染至DF-1细胞中过表达，利用间接免疫荧光技术检测红嘴鸥TLR7蛋白在转染DF-1细胞后不同时间点的表达特征。【结果】红嘴鸥TLR7基因CDS区长约1 182 bp,双酶切结果显示出2组大小不同的2条片段，分别为5 900、1 182 bp(原核表达载体)和5 428和1 182 bp(真核表达载体),测序后表明原核表达载体与真核表达载体构建成功。体外诱导温度为30℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L时培养5 h得到以包涵体形式大量表达的重组蛋白，蛋白大小为63 ku。间接ELISA法检测抗血清效价为1∶256 000以上。Western blotting检测结果表明，制备的多克隆抗体具有较好的特异性。间接免疫荧光结果显示，转染DF-1细胞2 h后即可观察到绿色荧光，随着时间增加绿色荧光密度逐渐增加，且绿色荧光大部分聚集在细胞核及周围，少部分散布在细胞质中。【结论】原核表达的红嘴鸥TLR7蛋白具有良好的免疫原性，制备的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性，TLR7蛋白可在DF-1细胞中成功表达。
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