木薯MeSSⅢ基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

作者：李崭; 王亚杰; 陆小花; 李瑞梅; 刘姣; 符少萍; 胡新文; 郭建春^*; 姚远^*

来源：分子植物育种, 2020, 18(16): 5367-5372.

DOI：10.13271/j.mpb.018.005367

• 木薯(Manihot esculenta Crantz.)
• 淀粉合成酶
• MeSSⅢ
• CRISPR

木薯块根淀粉葡聚糖链结构是决定淀粉品质的关键因素,可溶性淀粉合成酶Ⅲ(SSⅢ)是调控植物支链淀粉葡聚糖长链合成的关键酶,木薯有两个MeSSⅢ的同源基因MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2。为了研究木薯MeSSⅢ对木薯块根淀粉品质形成的影响,根据MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的保守区段,本研究构建了MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的双基因编辑载体。利用在线软件CRISPR-P v2.0同时设计靶标MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的sg RNA,通过酶切连接构建重组pCAMBIAP1301-Cas9-MeSSⅢ-gRNA质粒。将基因编辑载体转化农杆菌LBA4404后侵染木薯脆性胚性愈伤组织,筛选阳性脆性胚性愈伤组织,并提取其总DNA。通过PCR扩增靶点MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的区段,并将扩增片段进行Sanger测序,分析其编辑的靶标位点。结果发现MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2靶标位点被成功编辑,本研究有助于进一步获得MeSSⅢ基因突变体,以深入解析该基因在木薯淀粉合成通路中的作用。

• 单位
  农业部; 中国热带农业科学院热带生物技术研究所; 海南大学