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摘要
目的 制备抗新孢子虫NcASP5多克隆抗体，对NcASP5蛋白进行亚细胞定位；构建NcASP5基因敲除虫株(△NcASP5),探究NcASP5蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。方法 原核表达NcASP5蛋白，纯化后免疫小鼠，制备抗NcASP5蛋白多克隆抗体，免疫荧光法观察NcASP5蛋白亚细胞定位；运用CRISPR-cas9技术构建△NcASP5虫株，通过噬斑试验、入侵试验、增殖试验、逸出试验和动物试验探究NcASP5蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果 成功制备抗NcASP5蛋白多克隆抗体，免疫荧光法观察NcASP5蛋白定位于虫体细胞质；成功构建△NcASP5虫株，其噬斑面积、入侵率和逸出率与野生虫株比较差异均无统计学意义(均P>0.05),增殖率△NcASP5虫株在含1个与8个速殖子的纳虫空泡的数量所占百分比差异有统计学意义(P<0.05)。与感染野生虫株小鼠相比，感染△NcASP5虫株小鼠死亡时间延长2～4 d,组织中荷虫量差异无统计学意义(P>0.05)。结论 敲除NcASP5基因对新孢子虫虫体增殖有显著影响，而对虫体的生长、入侵及毒力等无显著影响，这为揭示新孢子虫致病机制和新孢子虫病防控提供了理论依据。
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