蓝舌病病毒群特异性RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

作者：李占鸿; 朱沛; 宋子昂; 李卓然; 杨振兴; 李华春; 杨恒^*; 廖德芳^*

来源：畜牧兽医学报, 2021, 52(08): 2244-2253.

DOI：10.11843/j.issn.0366-6964.2021.08.017

• 蓝舌病病毒
• 群特异性
• RT-LAMP
• 应用

本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据我国分离BTV毒株Seg-5基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化反应条件及反应体系,进行特异性及灵敏度验证,建立BTV RT-LAMP检测方法;对46株中国分离的12种血清型BTV (BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)代表毒株进行检测,进一步对120份BTV核酸阳性血液样品及60份2020年采集自监控动物的临床血液样品进行BTV的RT-LAMP及qRT-PCR检测,验证建立的RT-LAMP检测方法的准确性和可靠性。试验结果表明,本研究建立的RT-LAMP方法最佳反应条件为64℃,扩增45 min;反应体系中外引物∶内引物:环引物的最佳浓度及比例为0.2μmol·L-1∶0.6μmol·L-1∶0.4μmol·L-1。该方法可特异性检测中国流行的12种血清型BTV核酸,与动物流行性出血病病毒(EHDV)、中山病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)、口蹄疫病毒(FMDV)及非洲马瘟病毒(AHSV)核酸均无交叉扩增现象;最低可检测4.5拷贝·μL-1的BTV核酸。对46株分属12种血清型的BTV代表毒株的检测结果均为阳性;120份BTV核酸阳性血液样品的检测结果与qRT-PCR检测结果无显著差别(McNemar检验P>0.05),符合率为95.0%;60份临床血液样品的检测结果与qRT-PCR结果完全一致,以上结果表明本研究建立的RT-LAMP方法准确可靠,对中国分离的BTV毒株及临床血液样品均具有良好的检测效果。本研究建立的BTV RT-LAMP检测方法具有反应快速、结果可视化、特异性强和敏感度高等优点,为我国开展BTV检测诊断与流行病学研究提供了技术支持,具有较好的应用前景。

• 单位
  云南农业大学; 云南省畜牧兽医科学院