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摘要
目的建立靶向miR-374b的MIA3 psicheck2野生型及突变型载体,为双荧光素酶报告实验提供前期保障。方法构建MIA3 psicheck2野生型及突变型载体,首先根据小鼠MIA3—3’UTR序列信息设计其扩增引物,以小鼠血液全血基因组DNA为模板PCR扩增MIA3-3’UTR序列,并将其克隆至psicheck2双荧光素酶报告载体中。然后,设计突变引物将miR-374b种子序列靶标TATTATA突变成AAATTAT构建突变载体。其次,采用载体酶切鉴定及测序法对构建的载体进行鉴定。结果琼脂糖电泳分析,载体PCR扩增大小与理论大小相符合。DNA测序鉴定MIA3—3’UTR—WT载体构建成功。突变型载体的构建,成功将miR-374b种子序列靶标TATTATA突变成AAATTAT。结论 载体的成功构建,为进一步鉴定miR-374b与成软骨分化相关靶基因MLA3是否真正具有结合位点奠定了基础。
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