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摘要
目的探讨TRIM52反义RNA1(TRIM52-AS1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠脑皮层神经元损伤的影响及其可能机制。方法 (1)将体外培养的大鼠皮层神经元分为对照组和模型组, 模型组制备H/R诱导的细胞损伤模型, 采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测2组神经元TRIM52-AS1、微小RNA(miR)-28-5p的表达。(2)将皮层神经元分为对照组、模型组、TRIM52-AS1小干扰RNA(si-TRIM52-AS1)转染组和无义序列转染组, 后2组细胞分别转染si-TRIM52-AS1及其无义对照序列, 转染6 h后, 制备H/R诱导的细胞损伤模型。采用RT-qPCR、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、流式细胞仪分别检测4组神经元TRIM52-AS1的表达及细胞增殖、凋亡情况;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)、Western blotting分别检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量和Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白的表达。(3)将皮层神经元分为miR-28-5p转染组和无义序列转染组, 分别转染miR-28-5p模拟物及其无义对照序列, 转染6 h后, 均制备H/R诱导的细胞损伤模型。采用RT-qPCR、CCK-8、流式细胞仪分别检测2组神经元miR-28-5p的表达及细胞增殖、凋亡情况;采用ELISA及Western blotting分别检测培养上清中LDH、细胞中MDA、SOD含量和Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白的表达。(4)将皮层神经元分别分为野生型TRIM52-AS1+miR-28-5p模拟物转染组、野生型TRIM52-AS1+miR-28-5p无义对照序列转染组和突变型TRIM52-AS1+miR-28-5p模拟物转染组、突变型TRIM52-AS1+miR-28-5p无义对照序列转染组。转染6 h后换新鲜培养液继续培养12 h后, 采用双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞的荧光素酶活性。(5)将皮层神经元分为无义序列转染组、miR-28-5p抑制物转染组、无义序列+si-TRIM52-AS1转染组、miR-28-5p抑制物+si-TRIM52-AS1转染组, 分别转染miR-28-5p抑制物无义对照序列、miR-28-5p抑制物、miR-28-5p抑制物无义对照序列+si-TRIM52-AS1、miR-28-5p抑制物+si-TRIM52-AS1, 转染6 h后, 制备H/R诱导的细胞损伤模型。采用RT-qPCR、CCK-8、流式细胞仪分别检测4组神经元miR-28-5p的表达及细胞增殖、凋亡情况;采用ELISA及Western blotting分别检测培养上清中LDH、细胞中MDA、SOD含量和Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 (1)与对照组比较, 模型组神经元TRIM52-AS1的表达升高, miR-28-5p的表达降低, 差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组比较, 模型组和无义序列转染组神经元培养上清中LDH含量升高, 细胞中MDA、SOD含量降低, 细胞A值和Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达降低, 凋亡率和Bax蛋白的表达升高。与模型组和无义序列转染组比较, si-TRIM52-AS1转染组神经元TRIM52-AS1的表达降低, 培养上清中LDH含量和细胞中MDA含量降低, SOD含量升高, 细胞A值和Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达升高, 凋亡率和Bax蛋白的表达降低, 差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)与无义序列转染组比较, miR-28-5p转染组神经元miR-28-5p的表达增高, 培养上清中LDH含量和细胞中MDA含量降低, SOD含量升高, 细胞A值及Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达升高, 凋亡率及Bax蛋白的表达降低, 差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)野生型TRIM52-AS1+miR-28-5p模拟物转染组细胞的荧光素酶活性显著低于野生型TRIM52-AS1+miR-28-5p无义对照序列转染组(0.43±0.04vs. 1.00±0.09), 差异有统计学意义(P<0.05)。(5)与无义序列转染组比较, miR-28-5p抑制物转染组细胞miR-28-5p的表达明显降低, 培养上清中LDH和细胞中MDA含量升高, SOD含量降低, 细胞A值及Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达降低, 凋亡率及Bax蛋白的表达升高。与无义序列+si-TRIM52-AS1转染组比较, miR-28-5p抑制物+si-TRIM52-AS1转染组神经元中miR-28-5p的表达明显降低, 培养上清中LDH含量和细胞中MDA含量明显升高, SOD含量降低, A值及Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达降低, 凋亡率及Bax蛋白的表达升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。结论下调TRIM52-AS1可能通过靶向负调控miR-28-5p的表达抑制H/R诱导的大鼠脑皮层神经元的氧化应激和凋亡, 从而减轻神经元的损伤。
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单位郑州大学; 河南省人民医院
