siRNA特异性干扰EgTPx基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响

作者：郑璇; 卢帅; 文丽梅; 吕国栋; 李亚芬; 田春艳; 赵军; 王建华^*

来源：中国病原生物学杂志, 2019, 14(01): 37-43.

DOI：10.13350/j.cjpb.190108

• EgTPx基因
• 小干扰RNA
• 细粒棘球蚴原头节
• DNA氧化损伤

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgTPx基因表达后对细粒棘球蚴(Echi-nococcus granulosus,Eg)原头节DNA氧化损伤机制的影响。方法利用电穿孔法将EgTPx-siRNA干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgTPx-siRNA-60、115、250干扰组,阴性对照组和空白对照组。电转3d后,协同自然状态下原头节体外耐受H2O2最大浓度干预1h,综合伊红拒染试验和碱性磷酸酶检测干扰前后原头节活性变化及qRT-PCR检测干扰前后EgTPx-mRNA表达水平变化筛选最佳EgTPx-siRNA干扰序列。采用单细胞凝胶电泳法(彗星试验)检测干扰前后原头节DNA氧化损伤程度变化;采用试剂盒法检测原头节体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,分析siRNA干扰对DNA氧化损伤机制的影响。结果自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2的最大浓度为0.4mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法将绿色荧光干扰序列导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有绿色荧光斑点,而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点。导入siRNA后通过伊红拒染试验、碱性磷酸酶活性检测及qRT-PCR筛选出最佳干扰序列为EgTPx-siRNA-60;彗星试验显示干扰EgTPx基因表达后EgTPx-siRNA-60干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移形成拖尾,EgTPx-siRNA-60干扰组彗星尾距OTM值为12.860 2±2.537 7,与阴性对照组(0.055 8±0.010 3)和空白对照组(0.037 2±0.009 8)相比差异有统计学意义(t值分别为11.251和12.845,均P<0.01);经EgTPx-siRNA-60序列干扰后原头节体内ROS含量(13.978 6±0.233 0)A.U.与阴性对照组(3.281 7±0.052 5)A.U.和空白对照组(3.018 2±0.076 9)A.U.比较差异有统计学意义(t值分别为8.926和9.314,均P<0.01)。结论 EgTPx基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgTPx-siRNA-60可特异性干扰EgTPx基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力。

• 单位
  新疆医科大学; 新疆医科大学第一附属医院