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摘要
缺氧是实体瘤肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）的主要特征,与代谢重编程、免疫反应受损、基因组不稳定性增加等多种癌症特征有关,且与肿瘤恶性进展、治疗抵抗和患者不良临床结果相关。基于细胞培养实验和组织测序数据对缺氧的研究为理解缺氧在促进癌症发展中的分子机制提供了理论基础。但是缺氧对泛癌症组织中恶性细胞和肿瘤相关非恶性细胞的生物学功能和细胞表型影响的异同、缺氧环境下各种类型细胞之间的相互作用分子图谱、这些细胞参与的促癌信号途径以及参与关键细胞亚群的形成并介导促癌功能的关键分子都未完全阐明,仍然缺乏对缺氧微环境系统和深入的揭示。因此,本研究基于6种癌症424194个单细胞RNA测序数据和25种癌症组织多组学测序数据,采用Seurat R包、Cell Phone DB工具、基因集变异分析（Gene set variation analysis,GSVA）、Cox风险比例回归模型、差异分析、相关性分析以及体外细胞和分子实验等技术和方法,鉴定泛癌症中广泛存在的各类细胞亚群、研究各类细胞亚群对缺氧环境的响应情况、绘制细胞亚群之间相互作用网络以及确定促进癌症发展的信号途径。最后,基于缺氧与糖酵解的高度相关性,利用25种肿瘤组织转录组数据,揭示泛癌症糖酵解通路相关的多组学分子和信号通路特征,以期进一步揭示缺氧微环境下的细胞调控机制。具体的研究内容和结果总结如下:（1）基于单细胞转录组数据,在6种癌症中鉴定出肿瘤细胞、髓系细胞、成纤维细胞和T细胞等四种主要细胞类型的泛癌症广泛存在的细胞亚群:如细胞周期和上皮间质转化特征的肿瘤细胞、参与胶原合成过程的成纤维细胞、参与免疫抑制功能的CD4+Treg细胞和CD4+耗竭T细胞以及具有高缺氧分数的SPP1+肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）等。缺氧可能激活各类细胞糖酵解代谢、激活肿瘤细胞上皮间质转化、促进M2型TAMs的极化、参与SPP1+TAMs的扩增、上调TAMs中TIMP1及SPP1基因表达、激活TAMs中白介素10等抗炎信号。缺氧分数与T细胞耗竭分数呈显著正相关,且与T细胞抑制性受体PDCD1,TIGIT,HAVCR2,LAG3和CTLA4基因表达呈正相关。结合TCGA泛癌症样本研究表明细胞周期、细胞外基质重塑、角质化、糖酵解、白介素信号、胶原蛋白降解等信号通路在缺氧样本中高度富集。（2）各类细胞亚群之间相互作用结果显示,肿瘤相关成纤维细胞（Tumor-associated fibroblasts,CAFs）可能通过IGF/IGFR信号来激活乳腺癌和卵巢癌细胞的雌激素受体信号来促进细胞增殖;肿瘤细胞可能通过GAS6/AXL、VEGFA/NRP1和VEGFA/NRP2等信号激活M2型巨噬细胞极化信号;SPP1+TAMs可能通过SPP1/CD44信号来激活肿瘤细胞的糖酵解代谢和上皮间质转化过程;TAMs可能通过TNF/TNFRSF1B和TNF/FAS信号来激活Treg细胞以及通过LGALS9/HAVCR2信号来调节T细胞分化状态。TCGA泛癌症样本显示SPP1基因上调表达及SPP1+TAMs高浸润水平与包括肺癌在内的6种癌症患者的不良预后相关;SPP1+TAMs分子标签分数与T细胞耗竭分数呈正相关;SPP1基因在单细胞测序的缺氧样本中呈现显著上调表达。THP-1来源的巨噬细胞在缺氧条件（1%O2）培养下显著上调SPP1基因表达;分别用人重组蛋白SPP1和TNFSF12刺激后的A549人肺癌细胞表现出显著的迁移和侵袭表型且上调表达糖酵解和上皮间质转化的相关基因。（3）根据上面的结果显示缺氧样本富集出糖酵解通路,深入揭示糖酵解相关的多组学分子特征,有助于进一步全面揭示缺氧引起的一系列下游调控。本部分首先使用先前研究已定义糖酵解的样本验证了22个基因代表糖酵解活性的可行性;在所有癌症样本和肺癌单细胞中,糖酵解和缺氧GSVA分数呈现高度正相关且相关系数大于0.7;在7种癌症中糖酵解评分高的患者具有较差的预后;糖酵解和缺氧分数在多种癌症的肿瘤样本中均高于正常样本,且缺氧状态和糖酵解活性在不同癌症组织中呈现异质性分布。在大多数癌症类型中,高糖酵解肿瘤样本具有包括MYC等基因的拷贝数变异和TP53等基因的单核苷酸突变及较高的肿瘤突变负荷;TCA循环、DNA复制、G2M检查点、肿瘤细胞增殖、核苷酸合成和其他癌症相关的生物学过程在高糖酵解肿瘤中更活跃且糖酵解分数和细胞增殖分数具有显著的正相关。高糖酵解活性样本中上调的差异基因主要富集在葡萄糖代谢、细胞外基质重塑、细胞周期等信号通路;HSPA8和P4HA1基因表达分别与糖酵解分数及LDHA和PGK1等多个糖酵解基因表达高度相关,且在缺氧样本中上调表达,可能是在缺氧压力下调控的糖酵解的潜在因子。综上所述,在泛癌症肿瘤微环境中普遍存在的CAFs,TAMs,T细胞和肿瘤细胞的亚群对缺氧具有不同的响应机制;SPP1+TAMs在缺氧微环境中扩增,且在肺癌等癌症中与肿瘤细胞糖酵解和上皮间质转化、T细胞耗竭及患者不良预后有关系;缺氧程度和细胞糖酵解活性在各类癌症组织间有差异,糖酵解相关的多组学分子和信号通路特征与缺氧的对应特征之间存在异同,进一步说明缺氧与糖酵解的高度相关性,但也提示两者之间相关调控的复杂性。本研究提供了缺氧对泛癌症各类细胞生物学特征和功能的影响以及缺氧微环境下细胞之间相互作用网路,在泛癌中鉴定出多种有促癌作用的细胞亚群,为缺氧促进泛癌症进展的分子机制提供更加全面的理论依据,也为开发联合靶向肿瘤缺氧微环境和细胞交流信号的治疗策略提供新的依据。
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