DNA末端硫修饰依赖的体外大片段DNA连接法

作者：胡媚月; 吴更^*

来源：微生物学通报, 2023, 50(03): 1220-1230.

DOI：10.13344/j.microbiol.china.220583

• 硫原子识别结构域
• DNA连接组装
• DNA硫修饰
• 基因组合成

【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中，DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰)，而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有硫修饰识别结构域(sulfur-binding domain, SBD)的识别蛋白，可以特异性识别DNA上的硫修饰，这启发了我们发展出一种新的DNA组装技术。【目的】探究在DNA末端硫修饰的连接中，T4 DNA连接酶与SBD相融合蛋白和单独的T4 DNA连接酶相比，是否有更高的连接效率。【方法】根据同源重组原理，设计硫修饰引物，扩增硫修饰的DNA片段。构建T4 DNA连接酶与SBD融合蛋白的3种表达载体T4-linker-SBD(Hga)、T4-linker-SBD(Spr)和T4-linker-SBD(Mmo)，表达纯化以上3种融合蛋白。比较3组浓度梯度(2.4、0.24、0.024 mg/mL) T4 DNA连接酶与融合蛋白在2.5 kb和8.0 kb DNA片段连接上的差异。【结果】DNA末端硫修饰的2.5kb和8.0kb的两端片段均能扩增，而且3种融合蛋白均能表达。在两段2.5 kb片段的体外连接实验中，每组T4 DNA连接酶与融合蛋白均能连接成5 kb片段；然而在两段8.0 kb片段的体外连接实验中，相同连接时间和相同酶浓度下，仅融合蛋白T4-linker-SBD(Hga)能够将8.0 kb片段连接成16 kb的长片段。【结论】根据两组琼脂糖凝胶电泳的实验结果可知，在两段8.0 kb的DNA长片段连接实验中，T4-linker-SBD(Hga)融合蛋白具有更高的连接效率。本研究方法以较低的成本和比较高的效率为大片段DNA组装提供了一种新的方法和思路。

• 单位
  上海交通大学; 生命科学技术学院; 微生物代谢国家重点实验室