靶向猪内质网应激通路的microRNAs预测与验证

作者：朱静静; 周晓龙; 汪涵; 李向臣; 赵阿勇; 杨松柏^*

来源：中国农业科学, 2020, 53(15): 3169-3179.

• 猪
• 内质网应激通路
• miRNA
• ATF6

【目的】预测并验证靶向猪内质网应激通路中关键基因的microRNAs(miRNAs),为进一步研究miRNAs对猪内质网应激信号通路调控提供理论基础。【方法】首先利用伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾上皮(PK15)细胞,高通量测序检测差异表达的miRNAs。然后通过TargetScan预测靶向内质网应激通路关键基因ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的miRNAs。构建含有候选miRNAs作用位点的双荧光素酶报告基因重组载体,并分别与miRNA-mimics共转染幼仓鼠肾(BHK-21)细胞,通过测定荧光素酶活性来验证内质网应激通路关键基因与候选miRNAs的靶标关系。然后在PK15细胞中分别过表达候选miRNAs,利用qRT-PCR和Western blot检测候选miRNAs对内质网应激通路关键基因mRNA和蛋白表达的影响。【结果】miRNA测序结果显示,PRV感染后共引起35条miRNAs差异表达。TargetScan预测显示,靶向ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些交集miRNAs作为候选miRNAs。随后成功构建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶检测结果显示,miR-142-5p显著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR荧光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,过表达组的荧光素酶活性均极显著低于阴性对照组。同时miR-145-5p能够显著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR荧光素酶活性。这些结果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分别靶向ATF6、IRE1、XBP1,而其中miR-142-5p可能同时靶向这三个关键基因调控内质网信号通路。通过qRT-PCR和Western blot分析发现,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6的mRNA和蛋白表达,表明miR-142-5p靶向ATF6参与调控内质网应激信号通路。【结论】验证了靶向内质网应激通路关键基因ATF6的miRNA-miR-142-5p,为进一步研究miR-142-5p通过调控ATF6的表达而影响内质网应激信号通路奠定了基础。

• 单位
  浙江农林大学; 动物科技学院