华支睾吸虫3-磷酸甘油酸激酶基因的扩增、克隆及表达

作者：**; 余新炳; 徐劲; 吴忠道; 陈守义; 何东苟

来源：中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2004, 22(05): 52-54.

DOI：10.3969/j.issn.1000-7423.2004.05.015

• 3-磷酸甘油酸激酶
• 华支睾吸虫
• 克隆
• 原核表达

目的　构建编码华支睾吸虫 3 磷酸甘油酸激酶基因的原核表达载体 ,并分析其在大肠埃希菌中的表达。　方法　用Trizol法从华支睾吸虫 3 成虫体内提取总RNA ,并将其反转录成cDNA。根据华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶的已知基因 ,利用DNAclub和PCRdesign软件设计合成一对特异引物 ,从合成的cDNA中 ,用PCR技术扩增出目的片段。将目的片段和原核表达载体同时双酶切后连接 ,重组体转入JM10 9大肠埃希菌 ,用双酶切、PCR和测序筛选阳性克隆。挑选 1个阳性菌落 ,用异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达 ,表达产物进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)鉴定。　结果　用逆转录 聚合酶链反应技术扩增出 1条 12 48bp大小的片段 ,PCR产物测序鉴定正确 ;转化后得到 10个克隆 ,双酶切、PCR扩增鉴定 ,其中 6个为阳性克隆 ;表达产物用SDS PAGE鉴定 ,在相对分子质量 70 0 0 0处有 1条与理论预测的融合蛋白大小相一致的特异条带。　结论　成功构建重组原核表达载体pGEX 4T 1 PGK ,所表达的蛋白为含有谷胱甘肽的融合蛋白

• 单位
  中山大学中山医学院