APOBEC3B调控葡萄膜黑色素瘤复制应激的研究

作者：宗春燕; 何杰; 张哲; 贾仁兵; 沈键锋^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2022, 42(08): 1034-1044.

DOI：10.3969/j.issn.1674-8115.2022.08.008

• 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B(APOBEC3B)
• 葡萄膜黑色素瘤
• 复制应激
• 细胞周期检测点激酶1(CHK1)抑制剂

目的·研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B (apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B,APOBEC3B)在葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma,UM）中的生物学功能以及对药物治疗敏感性的影响。方法·应用免疫组织化学染色和Western blotting，分别检测眼部黑色素瘤[UM和结膜黑色素瘤（conjunctival melanoma,CM）]组织和细胞中APOBEC3B蛋白的表达水平。通过检索癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库，分析UM中APOBEC3B表达水平与预后的关联。使用CRISPR-Cas9质粒APOBEC3B-sgRNA敲除UM细胞系OMM2.3中APOBEC3B基因，构建APOBEC3B敲除的OMM2.3稳转细胞系sg APOBEC3B以及对照细胞系Vector；并通过克隆形成实验，探索APOBEC3B敲除对OMM2.3细胞增殖的影响。同时，通过APOBEC3B-shRNA和空载质粒建立APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞sh APOBEC3B和对照细胞shCtrl，对其进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq），检测差异基因，并通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）揭示APOBEC3B调控的下游通路。通过免疫荧光染色鉴定下游通路的关键蛋白。通过应用通路靶向药物处理，检测APOBEC3B对UM药物治疗敏感性的影响。结果·免疫组织化学染色结果表明眼部黑色素瘤（UM和CM）组织相较于良性色素痣组织APOBEC3B表达更高。Western blotting也表明包括OMM2.3细胞在内的大多数眼部黑色素瘤细胞相较于正常对照细胞（视网膜色素上皮细胞） APOBEC3B蛋白表达水平更高。并且TCGA数据库分析表明，APOBEC3B高表达的UM患者总生存期（P=0.032）和无病生存期（P=0.000）更短。然而APOBEC3B敲除并不影响OMM2.3细胞克隆形成的能力，APOBEC3B敲低也没有造成细胞周期的显著改变。sh APOBEC3B和shCtrl细胞系的RNA-seq差异基因富集分析结果显示，APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞的复制应激相关通路，并且热图分析也显示APOBEC3B敲低后DNA复制应激相关通路基因表达发生改变。免疫荧光染色结果显示，APOBEC3B敲低后复制应激通路关键靶标磷酸化的复制蛋白A 32 kDa亚基（replication protein A 32 kDa subunit,RPA32）水平降低。在对APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞和对照细胞的药物敏感性实验中，发现相较于sh APOBEC3B细胞，shCtrl细胞对细胞周期检测点激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1)抑制剂的敏感性更高。结论·APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞复制应激相关通路，且APOBEC3B表达的OMM2.3细胞对CHK1抑制剂的处理更为敏感。

• 单位
  上海交通大学医学院附属第九人民医院