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摘要
目的:构建RCA S1的重组质粒、表达GST-RCA S1融合蛋白并进行纯化和生物学活性鉴定。方法:从M CF-7细胞提取总RNA,通过RT-PCR得到RCA S1的扩增产物,纯化后用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切。选择pGEX-2T作为载体,用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切后与上述酶切后DNA连接,转化感受态JM 109大肠杆菌,挑单个菌落提取质粒进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒重新转化BL 21大肠杆菌,用终浓度0.1 mm o l/L的IPTG诱导表达GST-RCA S1蛋白,用GST亲和层析纯化并通过SDS-PAGE电泳和W estern印迹试验证实。利用特异性抗RCA S1多抗(N-18和C-20)鉴定所表达的融合蛋白,通过流式细胞仪检测GST-RCA S1融合蛋白诱导活化T细胞凋亡的作用。结果:通过RT-PCR得到大小为642bp的产物,重组质粒通过双酶切和测序鉴定正确。通过IPTG诱导在BL 21大肠杆菌中表达并纯化得到GST-RCA S1蛋白,通过SDS-PAGE电泳鉴定分子量为52 kM r,与预测一致,并由W estern印迹试验证明为GST融合蛋白。该融合蛋白能被特异性抗RCA S1(N-18和C-20)多抗识别。GST-RCA S1对诱导活化的T细胞凋亡有一定的作用。结论:成功构建RCA S1的重组质粒,并表达GST-RCA S1融合蛋白,对其生物学活性作了初步研究。
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