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摘要
目的探讨铁过载是否能够诱导成骨细胞发生坏死性凋亡, 并探讨其分子机制。方法采用50、100、200 μmol/L枸橼酸亚铁(FAC)对小鼠胚胎成骨细胞系(MC3T3-E1)进行干预, 以模拟铁过载状态;同样将加入等量生理盐水, 设为对照组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测铁过载对成骨细胞活性的影响, 流式细胞仪检测铁过载诱导成骨细胞的坏死率, 活性氧荧光探针(DCFH-DA)染色检测铁过载诱导成骨细胞内活性氧的水平, 蛋白印记法(Western blot)检测铁过载干预后成骨细胞内坏死性凋亡标志性分子受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)以及混合谱系激酶域样蛋白(MLKL)表达水平的变化。为了明确活性氧在铁过载诱导的成骨细胞坏死性凋亡中的作用, 我们应用抗氧化剂N-乙酰胺半胱氨酸(NAC)干预铁过载组的成骨细胞, 观察抑制活性氧后, 坏死性凋亡相关分子RIPK1、RIPK3及MLKL表达的变化。多组间比较应用单因素方差分析, 两组间比较采用t检验。结果 CCK-8结果显示, 铁过载干预120 h后能够明显抑制成骨细胞的活性, 和空白对照组(1.77±0.04)比较, FAC 50 μmol/L组(1.38±0.04)、FAC 100 μmol/L组(1.01±0.08)和FAC 200 μmol/L组(0.81±0.08)成骨细胞活性均受到抑制, 且具有浓度依赖性, 差异有统计学意义(t=19.22、12.22、17.07, P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示, 铁过载干预120 h后导致成骨细胞坏死率明显增加, 和空白对照组[(3.42±0.31)%]比较, FAC 50 μmol/L组[(10.25±4.62)%]、FAC 100 μmol/L组[(15.20±6.66)%]和FAC 200 μmol/L组[(41.53±3.97)%], 差异有统计学意义(t=4.116、3.061、16.560, P<0.05)。DCFH-DA染色后, 流式细胞仪检测结果显示, 铁过载干预120 h后导致成骨细胞内活性氧水平明显增加, 和空白对照组(1.00±0.00)比较, FAC 50 μmol/L组[(4.00±1.19)%]、FAC 100 μmol/L组[(8.10±3.63)%]和FAC 200 μmol/L组[(10.63±2.46)%]成骨细胞内活性氧水平逐渐升高, 且具有浓度依赖性, 差异有统计学意义(t=4.366、3.391、6.781, P<0.05)。Western blot检测结果显示, 铁过载干预120 h后, 和空白对照组(1±0)比较, FAC 50 μmol/L组、FAC 100 μmol/L组以及FAC 200 μmol/L组成骨细胞内坏死性凋亡标志性分子RIPK1表达含量分别为1.26±0.16、1.47±0.32、1.51±0.26, 组间差异有统计学意义(t=3.593、3.740、5.009, P<0.05);RIPK3表达含量分别为1.29±0.13、1.52±0.22、1.56±0.27, 组间差异有统计学意义(t=4.700、4.951、6.487, P<0.05)。应用抗氧化剂NAC干预铁过载组的成骨细胞后, FAC 200 μmol/L组、FAC 200 μmol/L+NAC组内成骨细胞活性氧水平分别为8.44±1.13、2.17±0.65, 组间差异有统计学意义(F=89.51, P<0.05);RIPK1表达含量分别为2.06±0.23、1.39±0.32, 组间差异有统计学意义(F=82.01, P<0.05);RIPK3表达含量分别为1.34±0.19、1.05±0.15, 组间差异有统计学意义(F=13.79, P<0.05)。结论坏死性凋亡参与了铁过载诱导的成骨细胞损伤。其中具体的分子机制主要是铁过载通过诱导成骨细胞内产生过多的活性氧, 进而通过激活RIPK1/RIPK3通路, 从而导致成骨细胞发生坏死性凋亡。
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