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摘要
目的原代乳鼠心肌细胞为终末期的分化细胞,常规的质粒转染效率低下。受体相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140,RIP140)目的基因长达3.5kb,为研究RIP140蛋白在非增殖型的心肌细胞表达情况,需要寻找一种更好的过表达系统。方法 RIP140基因全长序列克隆入p Ad Track-CMV穿梭载体中,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体p Ad Easy~(-1)进行同源重组。经酶切及测序验证的阳性重组克隆转染入AD293细胞中进行病毒的包装与扩增。采用TCID50法测定病毒滴度、CCK-8试剂盒分析腺病毒对心肌细胞活力的影响。采用Western blot鉴定RIP140蛋白在心肌细胞中的表达情况。结果测序分析结果表明RIP140的全长序列正确克隆到Ad Easy TM腺病毒系统中。AdRIP140、Ad-GFP的病毒滴度分别为1011.3和1011.7PFU·m L~(-1)。腺病毒感染复数在200以下时,对心肌细胞活力无影响。绿色荧光及Western blot分析显示Ad-RIP140感染心肌细胞12 h,RIP140表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了RIP140全长序列的腺病毒载体,并使其蛋白有效表达于心肌细胞中,这将有助于后续进行RIP140在心肌细胞中的作用的研究。
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