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摘要
本研究旨在以猪肺炎支原体为代表，研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶 (Leucine aminopeptidase，LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶，是生物生存和生长必不可少。研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。因此，LAP被作为新的抗菌/虫靶标。但是，迄今为止关于支原体LAP的研究较少。本研究拟以猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）LAP为模型，研究其理化特性和高级结构，探索LAP抑制剂乌苯美司（Bestatin）对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较，分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白，通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白，圆二色谱测定LAP的二级结构，用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高，但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后，分子筛层析显示LAP是六聚体，圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制，且呈现剂量依赖性，但在不同菌株间存在差异，最低在6 μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供新了的思路。
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