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摘要
目的建立去除荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)体系中内源性核酸污染的方法,用于降低或排除颅内术后易感染细菌的荧光定量PCR检测出假阳性的概率。方法首先去除荧光定量PCR反应体系中的内源性核酸污染;随后利用多重PCR技术,以混合菌DNA作为模板进行革兰菌特异性鉴定;并研究去除污染后的多重PCR技术检测混合细菌DNA的检测限和灵敏度。结果建立的方法能够快速有效地去除荧光定量PCR体系内的内源性核酸污染,并对PCR体系中Taq酶的活性以及扩增效率均无影响,最低检测限为102 CFU/m L(金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌),与培养法相同。酶切法对PCR体系中酶的活性及扩增效率均无明显影响,且对PCR反应体系及引物特异性没有影响(循环数Ct=32,荧光强度ΔRn=200)。过滤法却使PCR扩增效率显著下降(循环数Ct=32,荧光强度ΔRn=150)。结论酶切法去除内源性核酸污染对荧光定量PCR检测限及灵敏度均无影响,操作简便快速,降低了PCR检测的假阳性概率,能及时准确地诊断颅内细菌感染。
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单位南方医科大学深圳医院; 深圳市儿童医院
