重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究

作者：张超; 巩蔚; 郭莹莹; 孙卫国; 姚敏; 于爱平

来源：中国生物工程杂志, 2014, 34(12): 69-77.

DOI：10.13523/j.cb.20141210

• 新蛭素
• 原核表达
• 可溶性表达
• 抗凝

目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过PCR的方法获得eh的c DNA,PCR产物连接入原核表达载体p ET-22或p ET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(ply Ss),获得重组工程菌BL21(DE3)-p ET-24-eh,BL21(DE3)-p ET-22-eh,BL21(ply Ss)-p ET-22-eh。重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为BL21(DE3)-p ET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4μmol/L,诱导前菌种密度在OD600=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。

• 单位
  中国人民解放军军事医学科学院; 中国人民解放军第309医院