采用CRISPR knockin技术实现VEGF165定点敲入HEK293T细胞系的构建

作者：郭再玉^*; 张合亮; 陈谦; 侯延伟; 水涛; 武莉莉; 刘艺洁; 费乔曼; 黄欢; 雷蕾; 孙琰; 孔雨; 赵秀娟; 韩雅婷; 杨冰; 张玲

来源：国际生物医学工程杂志, 2019, 42(01): 39-44.

• 血管内皮生长因子165
• CRISPR/Cas9
• HEK293T细胞

目的构建定点敲入血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的人肾上皮细胞系HEK293T, 避免由慢病毒感染等方法实现过表达时所带来的脱靶效应。方法根据EZH2基因的DNA序列设计、构建两端带有同源臂的VEGF165表达载体(pUCm-T-VEGF165质粒)和能定点切割基因组DNA的小向导RNA(sgRNA)表达载体[pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒], 再将这两个质粒共转染HEK293T细胞, 通过实时荧光定量PCR检测VEGF165和EZH2的mRNA表达情况, 蛋白质印迹法(Western Blot)检测VEGF165和EZH2的蛋白表达情况。结果实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示, 与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组比较, 共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高(VEGF165 mRNA:3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18, 均P<0.01;VEGF165蛋白:3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05, 均P<0.01), EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低(EZH2 mRNA:0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16, 均P<0.01;EZH2蛋白:0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06, 均P<0.01)。该结果表明VEGF165基因被定点插入EZH2基因的基因组DNA序列中, 并干扰了EZH2的表达。结论采用CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入VEGF165基因的HEK293T细胞系。

• 单位
  中国人民武装警察部队后勤学院; 天津医科大学; 基础医学院