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摘要
花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)是花椒(Zanthoxylum bungeanum)树上的重要蛀干害虫,深入了解其嗅觉感受机制,有助于研究化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)在其化学感受系统中的作用。基于本课题组转录组测序结果 ,本研究克隆获得花椒窄吉丁化学感受蛋白基因(A. zanthoxylumi chemosensory protein, Azan CSP3)的c DNA,利用在线工具(Expasy; Signal P4.1; Swiss model)对其进行理化特性分析;利用BLAST进行同源性对比,并用MEGA 10.0软件Neighbor-joining法构建进化树,进而分析其与鞘翅目其他11种昆虫化学感受蛋白的亲缘关系;将原核表达载体p ET28a(+)与克隆鉴定正确的重组质粒相连接,然后转入至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside, IPTG)诱导后表达,用SDS-PAGE电泳分析目的融合蛋白的表达情况后,用Western blot检测所表达的蛋白是否为目标融合蛋白。结果表明,克隆获得花椒窄吉丁1条化学感受蛋白的c DNA序列,与转录组数据结果一致,其全长为846 bp,含有396 bp的完整开放阅读框,编码132个氨基酸,成熟蛋白分子质量为15.038 k D,等电点9.16,预测N末端含有28个氨基酸组成的信号肽;Azan CSP3的三维结构具有6个保守的α-螺旋,并形成1个疏水性的结合腔,具有化学感受蛋白家族的典型特征。氨基酸序列比对表示Azan CSP3与其他鞘翅目昆虫的CSP序列同源性较高,其中与苹果小吉丁(A. mali)Amal CSP4氨基酸序列同源性最高,为87.79%,系统发育结果表明,花椒窄吉丁Azan CSP3与苹果小吉丁Amal CSP4、白蜡窄吉丁(A. planipennis)的Apla CSP3以100%置信度聚为一支。Western blot检测结果表明,花椒窄吉丁Azan CSP3在大肠杆菌中成功表达。本研究明确了花椒窄吉丁化学感受蛋白Azan CSP3的结构特征,为深入研究花椒窄吉丁化学感受蛋白的功能特性、揭示花椒窄吉丁嗅觉识别机制提供了理论依据。
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