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摘要
[背景]甲基汞(MeHg)是一种神经毒物，褪黑素(MT)对神经系统具有保护作用，但其能否拮抗MeHg诱导的神经细胞损伤及其机制尚不清楚。[目的]采用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)为研究对象，通过建立MeHg诱导SH-SY5Y细胞衰老模型，观察自噬相关蛋白、溶酶体数量与功能的改变以及MT在其中的干预作用和机制。[方法](1)采用不同剂量MeHg(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4μmol·L-1)处理SH-SY5Y细胞48 h，细胞活性检测试剂盒(CCK-8法)检测细胞活性并计算存活率，并采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测衰老细胞情况。(2)筛选出可明显引起SH-SY5Y细胞衰老的MeHg剂量(即0.5μmol·L-1)，并采用其1/2和1/4的剂量(即0.25和0.125μmol·L-1)分别作为中、低剂量组进行染毒。(3)MT干预实验分为4组：对照组(0.1%DMSO)、染汞组(0.5μmol·L-1 MeHg)、单纯MT组(1 mmol·L-1 MT)、MT干预组(1 mmol·L-1 MT+0.5μmol·L-1 MeHg)。MT干预组为1 mmol·L-1 MT预处理细胞24 h后0.5μmol·L-1 MeHg染毒48 h。(4)SA-β-gal染色观察细胞衰老；Western blotting检测衰老相关蛋白p16，自噬相关蛋白p62、LC3Ⅱ以及溶酶体相关蛋白LAMP1、LAMP2、TFEB的表达水平；溶酶体红色荧光探针染色检测溶酶体数量；溶酶体绿色荧光探针检测溶酶体p H变化；电镜观察溶酶体形态学变化。[结果] CCK-8结果表明，随着染毒浓度增加细胞存活率降低；与对照组相比，0.5μmol·L-1MeHg染毒组SA-β-gal染色蓝染细胞率增多了48%(P <0.01),p16和p62及LC3Ⅱ蛋白表达水平明显增高(P <0.05);LAMP1、LAMP2蛋白水平与溶酶体红色及绿色荧光探针的荧光强度随MeHg浓度的升高而降低(P <0.05)；电镜结果表明溶酶体体积增大。与MeHg染毒组相比，1 mmol·L-1 MT+0.5μmol·L-1 MeHg处理组p16蛋白表达降低及SA-β-gal染色蓝染细胞率降低了19%(P <0.05),p62及LC3Ⅱ蛋白表达明显降低，LAMP1、LAMP2蛋白表达与溶酶体红色及绿色荧光探针的荧光强度均有所增加，TFEB入核显著增加，差异具有统计学意义(P <0.05)。[结论] MeHg可能通过减少SH-SY5Y细胞溶酶体数量及损伤溶酶体活性致细胞衰老，MT可改善MeHg所致SH-SY5Y细胞溶酶体异常进而干预细胞衰老。
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