miR-761通过抑制γ-氨基丁酸受体相关蛋白的表达促进主动脉瓣膜钙化

作者：向熠; 李晓蓉; 罗江乔; 何文欢; 金渝佳; 常静; 施琼^*

来源：陆军军医大学学报, 2023, 45(16): 1702-1711.

DOI：10.16016/j.2097-0927.202303056

• miR-761
• γ-氨基丁酸受体相关蛋白
• 自噬
• 主动脉瓣膜钙化

目的 探讨miR-761对钙化性主动脉瓣膜疾病(calcified aortic valve disease, CAVD)的影响及其潜在机制。方法 于2022年1月至2023年1月从重庆医科大学附属第一医院心胸外科收集正常(6例)和钙化(8例)的瓣膜组织，采用Western blot、免疫组织化学染色和RT-qPCR检测钙化瓣膜组织中自噬基因、成骨基因、γ-氨基丁酸受体相关蛋白(Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein, GABARAP)或miR-761表达的变化；双荧光素酶实验验证miR-761与GABARAP 3′-UTR区的结合；通过细胞免疫荧光实验对分离的猪主动脉瓣膜间质细胞(porcine aortic valve interstitial cells, pVICs)进行表型鉴定；在pVICs中转染miR-761 mimic、inhibitor以及相应的对照构建过表达或敲低miR-761的pVICs细胞系，加入GFP-LC3腺病毒后观察自噬小体数量的变化。成骨培养基(osteogenic medium, OM)处理pVICs前后分别采用Western blot、碱性磷酸酶染色和茜素红S染色检测pVICs的成骨分化能力。结果 与正常组织比较，钙化瓣膜组织中α-SMA、RUNX2、Beclin 1、ULK1和GABARAP蛋白表达上调，p62蛋白、miR-761表达下调(P<0.05);双荧光素酶实验验证了miR-761与GABARAP 3′-UTR区的结合(P<0.05);分离出的pVICs表达间质细胞标记物α-SMA、Vimentin,不表达内皮细胞标记物CD31;共聚焦显微镜结果显示，敲低miR-761使pVICs的自噬小体生成增多；此外，蛋白、碱性磷酸酶染色、茜素红S染色结果均显示，敲低miR-761显著增加pVICs中的GABARAP的表达，显著降低OPN、α-SMA、RUNX2、CollagenⅠ的表达(P<0.05),抑制OM诱导的细胞钙盐沉积。结论 miR-761可能通过抑制GABARAP的表达抑制自噬，促进心脏瓣膜钙化。

• 单位
  重庆医科大学; 重庆医科大学附属第一医院