鳗鲡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

作者：李英英; 杨金先; 陈曦; 陈强; 宋铁英^*; 葛均青^*

来源：水产学报, 2021, 45(05): 769-777.

• 鳗鲡疱疹病毒
• 荧光定量PCR
• SYBR GreenⅠ
• 检测方法

为了建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。结果显示,qPCR的阈值循环数(cycle threshold value, CT)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为100.855%;该方法特异性好,可特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV)和鳗鲡虹彩病毒(Eel iridovirus, EIV)无扩增;该方法重复性强,组内和组间变异系数分别小于1%和2%;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1 000个病毒拷贝。qPCR检测发现,在感染AngHV的欧洲鳗鲡主要组织内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量显著高于其他组织;对保存的25份疑似鳗鲡"脱黏败血综合征"病料进行检测,阳性检出率为96%,而普通PCR法的阳性检出率仅为76%。本研究建立的AngHV SYBR GreenⅠqPCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡"脱黏败血综合征"的防控也具有重要意义。

• 单位
  福建省农业科学院