大鼠PAX6基因真核表达载体构建及鉴定

作者：严会文; 苏敏; 高杰; 廖文萍; 闫丽丽; 黄悦

来源：贵阳医学院学报, 2016, 41(03): 288-293.

DOI：10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.03.012

• 绿色荧光蛋白
• PAX6基因
• 表达载体,真核
• 脂质体
• 转染

目的:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因及PAX6基因的重组真核表达载体,观察其在人胚肾细胞(293FT)细胞中的表达。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)从大鼠脑组织中获取PAX6基因,经连接T载体测序验证正确后,与真核表达载体p EF1α-IRES-Ac GFP经Sal I/Bam HI双酶切后;经T4 DNA连接酶连接,获得重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,用菌液PCR、Sal I/Bam HI双酶切及测序鉴定正确后,用脂质体法转染293FT细胞,采用倒置荧光显微镜观察GFP的表达、蛋白印迹(Western blot)法检测PAX6蛋白表达。结果:重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP经RT-PCR和双酶切均得到大小为1 269 bp的目的条带,测序鉴定该序列与Gen Bank中大鼠PAX6基因序列的同源性达100%,插入基因的大小和方向正确;重组质粒转染293FT细胞后可见GFP绿色荧光,Western blot显示PAX6蛋白表达。结论:成功构建了PAX6真核表达重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,能在293FT细胞中表达PAX6蛋白。

• 单位
  贵州医科大学