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摘要
目的探讨M2巨噬细胞外泌体(M2 macrophage exosomes,M2-exo)对高糖高胰岛素条件下小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs)成骨分化及Hedgehog信号通路的影响。方法诱导小鼠巨噬细胞系RAW 264.7向M2极化后,提取并鉴定M2-exo,检测BMSCs对外泌体的摄取内吞。将BMSCs分为正常对照组(Control组,使用不含胰岛素、不含M2-exo,且葡萄糖浓度为5.5 mmol/L成骨诱导培养基)、高糖高胰岛素组(HGI组,使用含25 mmol/L葡萄糖及174 nmol/L胰岛素的成骨诱导培养基)及高糖高胰岛素M2-exo干预组(HGI+M2-exo组,使用与HGI组相同的培养基,并分别添加6、30、60μg/mL的M2-exo),成骨诱导7 d后行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,成骨诱导14 d后行茜素红染色,评估各组BMSCs成骨分化能力。另取Control组、HGI组、HGI+30μg/mL M2-exo组BMSCs细胞,成骨诱导培养14 d后(qPCR)及成骨诱导21 d后(Western blot)检测成骨及Hedgehog信号通路相关基因及蛋白的表达。结果成功诱导M2巨噬细胞极化,M2极化表面标志物CD206呈强阳性表达。M2-exo呈典型的类圆形双层膜性囊泡结构,粒径主要分布于50～125 nm之间(占总粒子数的99.14%),外泌体标志蛋白CD9、CD63和CD81呈阳性表达。免疫荧光显示M2-exo可被小鼠BMSCs摄取内化。成骨诱导7 d后,HGI组BMSCs的ALP活性低于Control组,经6μg/mL、30μg/mL及60μg/mL的M2-exo干预后,HGI+M2-exo组ALP活性有所逆转,与HGI组相比差异有统计学意义(P<0.05);成骨诱导14 d后,HGI组矿化结节数量较Control组减少,仅HGI+30μg/mL M2-exo组干预后其矿化水平高于HGI组(P<0.05)。qPCR结果显示,HGI组成骨分化相关基因Alp、Runx2、Ocn及Hedgehog通路相关基因Gli1、Smo、Ptch1 mRNA水平与Control组相比均有不同程度的降低,而30μg/mL M2-exo干预可促进这些基因的上调,与HGI组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,HGI组成骨相关蛋白RUNX2、COL1A1及Hedgehog通路蛋白GLI1的表达下调,而经30μg/mL M2-exo干预可促进COL1A1及GLI1的表达上调,与HGI组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论高糖高胰岛素对BMSCs成骨分化具有抑制作用。M2-exo干预后,BMSCs的Hedgehog信号通路激活且成骨分化能力增强,提示M2-exo具有用于糖尿病骨修复的潜力。
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单位口腔疾病研究国家重点实验室; 四川大学华西口腔医院; 中山大学; 中山大学附属口腔医院
