鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

作者：叶丽娜; 谢芝勋^*; 谢丽基; 王盛; 邓显文; 谢志勤; 范晴; 黄娇玲; 曾婷婷; 张艳芳; 罗思思

来源：南方农业学报, 2019, 50(06): 1362-1368.

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.06.28

• 禽呼肠孤病毒
• σA蛋白
• cDNA文库
• 互作蛋白
• 酵母双杂交

【目的】构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds c DNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建c DNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析。【结果】构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106CFU,文库滴度为3.1×108CFU/mL,插入片段大小集中在300～2000 bp,重组率为91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9)。【结论】通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。

• 单位
  广西壮族自治区兽医研究所