AMPK对过氧化氢诱导细胞衰老的阻遏研究

作者：陈翠; 龚蕾; 徐晢; 汪小波^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(06): 2255-2264.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.06.009

• AMPK基因
• 持续激活型
• 稳转细胞株
• NIH3T3细胞
• 衰老

【目的】构建稳定表达腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)/AMPK-T172D的NIH3T3细胞株，探讨AMPK对过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)诱导的细胞衰老的影响。【方法】采用PCR扩增AMPK基因及其突变形式AMPK-T172D,将其克隆至慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中，构建pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D重组质粒并进行双酶切验证。将构建好的重组质粒包装成慢病毒，感染NIH3T3细胞，并利用嘌呤霉素筛选获得NIH3T3稳转细胞株。采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测稳转细胞株中AMPK的mRNA和蛋白表达情况。利用8.8 mmol/L H2O2处理AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3细胞株，培养2 d后，采用衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase, SA-β-Gal)染色检测细胞衰老情况，利用实时荧光定量PCR检测p53、p21及IL-6基因的表达情况。【结果】双酶切验证结果显示，pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D表达质粒构建成功。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，与对照组相比，AMPK/AMPK-T172过表达的NIH3T3细胞中AMPK和AMPK-T172D mRNA和蛋白表达水平均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-1)和脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)mRNA表达水平显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),SA-β-Gal细胞阳性率极显著降低(P<0.01);p53、p21和IL-6基因mRNA表达水平显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01)。【结论】试验成功获得AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3稳转细胞株，激活AMPK能降低H2O2诱导的衰老细胞中SA-β-Gal细胞阳性率和衰老相关因子p53、p21和IL-6的表达。试验结果为研究AMPK在衰老中的作用、可能的分子机制及抗衰老治疗策略提供依据。

• 单位
  大理大学; 曲靖医学高等专科学校; 基础医学院