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摘要
目的研究补阳还五汤抗同型半胱氨酸(Hcy)诱导的脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的作用及机制。方法以补阳还五汤连续灌胃SD大鼠1周,提取补阳还五汤含药血清。将HUVEC置于5%CO2、37℃细胞恒温培养箱中培养,当细胞汇合度达到80%,选取对数期细胞,开始分组与模型制备。将HUVEC随机分为10组:空白组(10%空白血清)、模型组(10%空白血清+Hcy)、小中大3个百分含量实验组(5%,10%,20%补阳还五汤)、模型组-Ⅰ(10%胎牛血清+Hcy)、抑制剂-Ⅰ组(10μmol·L-1MAPK抑制剂SB203580+Hcy)、抑制剂-Ⅱ组(10μmol·L-1ERK抑制剂PD98059+Hcy)、抑制剂-Ⅲ组(10μmol·L-1Rho激酶抑制剂Y27632+Hcy)、抑制剂-Ⅳ组(10μmol·L-1MLCK抑制剂ML-7+Hcy),且Hcy造模浓度为3 mmol·L-1。用噻唑蓝(MTT)测定Hcy对HUVEC的毒性作用;用蛋白质印迹法测定丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白的表达量;用MillicellERS电阻仪测定各组单层细胞跨膜电阻值(TEER)的变化。结果与空白组的光密度值(代表细胞增值)为0.95±0.05比较,7个Hcy梯度组的光密度值分别是0.91±0.06,0.88±0.08,0.68±0.06,0.60±0.07,0.58±0.04,0.51+0.06,0.40+0.02,差异有统计学意义(P<0.05)。P38MAPK蛋白的相对表达量:空白组、模型组、小中大3个百分含量实验组、模型对照组(即模型-Ⅰ组)及4个抑制剂组分别是0.42±0.06,1.10±0.12,0.33±0.03,0.68±0.08,0.46±0.04,0.42±0.03,0.37±0.04,0.48±0.05,0.32±0.02,0.63±0.08。磷酸化P38MAPK蛋白相对表达量以上各组分别是0.12±0.01,0.42±0.04,0.40±0.05,0.18±0.02,0.20±0.01,0.22±0.02,0.18±0.02,0.30±0.03,0.17±0.01,0.19±0.02。与空白组比较,模型组的P38MAPK、磷酸化P38MAPK表达量显著增加,差异有明显统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,中高2个百分含量实验组和抑制剂组,磷酸化P38MAPK蛋白相对表达量表达显著下降,差异有明显统计学意义(P<0.01);与模型组比较,小百分含量实验组的P38MAPK显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。磷酸化ERK1/2蛋白相对表达量:空白组、模型组、小中大3个百分含量实验组、模型对照组(即模型-Ⅰ组)及2个抑制剂组分别是0.69±0.03,0.95±0.05,0.41±0.02,0.50±0.03,0.51±0.04,0.91±0.03,0.80±0.02,0.69±0.03。与空白组比较,模型组的Pho-ERK1/2蛋白表达量显著增加,差异有明显统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,小中高3个百分含量实验组的Pho-ERK1/2蛋白表达显著下降,差异有明显统计学意义(P<0.01);与模型组比较,抑制剂-Ⅰ、抑制剂-Ⅱ组的Pho-ERK1/2蛋白显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。ERK1/2蛋白相对表达量各组依次是0.55,0.60,0.59,0.58,0.58,0.59,0.60,0.60,与模型组比较,各组差异无统计学意义(P>0.05)。HUVEC细胞单层跨膜电阻值(TEER):空白组、模型组、小中大3个百分含量实验组、模型对照组(即模型-Ⅰ组)及4个抑制剂组依次是(60.48±1.61),(13.44±0.95),(40.32±0.92),(41.44±0.89),(36.96±1.59),(13.44±1.36),(24.64±1.32),(30.24±1.67),(24.64±0.72),(23.52±0.74)Ω·cm-2。与空白组比较,模型组的内皮细胞TEER值显著降低,差异有明显统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,小中高3个百分含量实验组、抑制剂组的TEER值显著上升,差异有明显统计学意义(P<0.01);与模型组比较,模型-Ⅰ组差异无统计学意义(P>0.05)。结论补阳还五汤通过调节内皮细胞P38MAPK、ERK1/2蛋白通路,减少细胞骨架的变化,阻止细胞通透性变大,从而发挥抗内皮细胞损伤作用。
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单位南昌大学; 江西中医药大学药学院; 第一附属医院消化内科
