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摘要
目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）能否延缓软骨细胞衰老及其作用机制。方法 取4周龄SPF级SD大鼠关节软骨，采用Ⅱ型胶原酶分步消化法分离培养软骨细胞并传代。经甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色鉴定后，将第2代细胞分为空白对照组、10 ng/mL IL-1β培养组以及6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μmol/L EGCG+10 ng/mL IL-1β共培养组，对应培养24 h后采用细胞计数试剂盒8观测软骨细胞活性，筛选EGCG最佳药物浓度进行下一步实验。进一步将第2代软骨细胞分为空白对照组（A组）、10 ng/mL IL-1β培养组（B组）、EGCG+10 ng/mL IL-1β共培养组（C组）、EGCG+10 ng/mL IL-1β+5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组（D组），对应培养后采用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老程度，单丹磺酰尸胺法检测细胞自噬情况，实时荧光定量PCR检测软骨细胞衰老相关基因[Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、MMP-13）]表达水平，Western blot检测软骨细胞相关蛋白（Beclin-1、LC3、MMP-3、MMP-13、Ⅱ型胶原、P16、mTOR、AKT）表达水平。结果 经鉴定分离培养细胞为软骨细胞。与空白对照组相比，10 ng/mL IL-1β培养组细胞活力降低（P<0.05）；与10 ng/mL IL-1β培养组相比，各浓度EGCG+10 ng/mL IL-1β共培养组细胞活力上升，其中50.0、100.0、200.0μmol/L EGCG明显促进软骨细胞活性（P<0.05）；研究选择100.0μmol/L EGCG进行后续实验。与A组相比，B组细胞呈衰老变化。与B组相比，C组软骨细胞衰老率降低，自噬增强，Ⅱ型胶原mRNA相对表达量上调，MMP-3和MMP-13 mRNA相对表达量下调；Beclin-1、 LC3及Ⅱ型胶原蛋白相对表达量上调，但P16、MMP-3、MMP-13、mTOR及AKT蛋白相对表达量下降；上述差异均有统计学意义（P<0.05）。与C组相比，当D组添加3-MA后，软骨细胞衰老率上升、自噬减少，上述目标蛋白及mRNA相对表达量均呈相反趋势变化（P<0.05）。结论 EGCG通过PI3K/AKT/mTOR通路调控软骨细胞自噬水平，发挥抗衰老作用。
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