科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的探讨骨肉瘤阿霉素耐药细胞外泌体与MDR1、miRNAs的相关性及作用机制。方法选取骨肉瘤MG63和U2OS细胞株构建阿霉素耐药株, 通过MTT法检测耐药和敏感株的50%抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50), 于15～120 min中间隔15 min观察一次荧光染色检测荧光强度的变化, RT-PCR和Western Blot检测MDR1的mRNA和P-gp蛋白表达水平等验证骨肉瘤细胞耐药性;通过粒径分析及Western Bolt检测鉴定外泌体。观察PKH26标记的阿霉素耐药细胞外泌体的胞吞作用, 并采用MTT法和细胞划痕实验检测阿霉素耐药细胞外泌体与骨肉瘤细胞共培养后细胞的增殖水平、迁移能力及耐药性的变化。通过骨肉瘤源性外泌体测序及生物信息分析、RT-PCR验证miRNAs在骨肉瘤敏感和耐药细胞中的mRNA差异表达水平。观察MG63和U2OS中正常骨肉瘤细胞组与耐药细胞组、耐药细胞+正常外泌体组、耐药细胞+耐药外泌体组成瘤裸鼠肿瘤生长情况, 血清外泌体鉴定及其miR-21-5p的mRNA表达水平, RT-PCR、Western Blot和免疫组化检测肿瘤组织中MDR1的mRNA和miR-21-5p蛋白的表达水平。结果 MG63和U2OS中阿霉素耐药株IC50(11.81、9.33 μg/ml)高于正常株(2.21、0.93 μg/ml), 荧光强度减弱速度高于正常株, MDR1的mRNA和P-gp的蛋白表达水平(2.15±0.10、2.127±0.12;0.92±0.11、0.73±0.10)均高于正常株(1.12±0.16, 1.02±0.11;0.46±0.03、0.30±0.04), 差异均有统计学意义(P<0.05)。耐药外泌体分别与正常株共培养时可通过胞吞作用进入骨肉瘤细胞内集中分布于细胞质。骨肉瘤细胞与耐药外泌体共培养, 分别以2、4、6、8 μg/ml的阿霉素浓度处理后, 耐药组增殖水平显著上升, 耐药组迁移能力(54.20±9.32, 19.24±2.88;76.40±5.41, 30.26±4.87)较正常组(35.947±3.922, 6.72±3.546;51.217±5.546, 19.31±1.930)均高, 差异有统计学意义(P<0.05)。选择外泌体测序和生信分析中10种上调明显的miRNAs, 进行RT-PCR验证其在正常和耐药株中的mRNA表达差异性, 其中耐药株miR-372-3p、miR-21-5p、miR-155-5p表达水平均显著升(MG63:5.89±0.26vs. 0.99±0.06;U2OS:1.05±0.07vs. 8.80±0.93), 差异有统计学意义(P<0.05)。MG63和U2OS中正常细胞组与耐药细胞组比较、正常外泌体组与耐药外泌体组比较, 后两者裸鼠肿瘤体积呈现不同程度的增速;终末肿瘤重量不同程度地增加。血清外泌体中耐药组miR-21-5p的mRNA表达水平(1.13±0.12、1.14±0.12;0.90±0.07, 0.93±0.04)均较正常组(0.86±0.07、0.86±0.05;0.71±0.05, 0.75±0.03)增高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。结论骨肉瘤耐药细胞外泌体通过细胞间传递MDR1基因、miRNAs使细胞的增殖水平和迁移能力增强;耐药细胞及其成瘤裸鼠血清和肿瘤组织中MDR1基因、miR-21-5p表达上调, 提示其可能参与调节骨肉瘤MG63、U2OS的耐药过程。
-
单位内蒙古医科大学第二附属医院
