甘薯WRKY转录因子IbWRKY61互作蛋白的筛选及鉴定

作者：张凯; 刘莹莹; 彭德良; 吴正丹; 毛丽敏; 唐道彬; 王季春^*

来源：农业生物技术学报, 2020, 28(12): 2118-2129.

• 甘薯
• WRKY
• 酵母双杂交(Y2H)
• 互作蛋白
• 双分子荧光互补技术(BiFC)

WRKY转录因子在植物的生物和非生物胁迫应答响应中具有重要的调控作用。为了阐明甘薯(Ipomoea batatas) WRKY转录因子IbWRKY61的生物学功能并明确其在蛋白互作网络中的作用,本研究采用Gateway技术构建其诱饵载体pGBKT7-DEST-IbWRKY61,利用酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)技术筛选甘薯cDNA文库。结果显示,通过酵母双杂交筛库获得241个阳性克隆;将所有阳性克隆子摇菌培养,对插入片段进行PCR扩增,进一步筛选出121个单克隆。对PCR产物回收并混样进行高通量测序,利用STAR将测序数据比对到基因,根据TPM (transcripts per million)值筛选出100条互作蛋白编码基因序列;在NCBI进行比对,发现IbWRKY61互作蛋白主要与生物胁迫和病原菌防御相关。从中筛选出12个互作蛋白,利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)进行互作验证,12个互作蛋白均通过酵母双杂交得到验证;BiFC结果表明,IbWRKY61与碳分解代谢物阻遏蛋白4 (carbon catabolite repression, CCR4)相关因子1 (CCR4-associated factor 1, CAF1)在本氏烟草(Nocotinan benthamiana)叶肉细胞的细胞核互作,与泛素激活酶E1、Clp蛋白酶蛋白水解亚基相关蛋白2 (Clp protease proteolytic subunit-related protein 2, CLP2)和富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶BIR1 (BAK1-interacting receptor-like kinase 1)分别在细胞质膜、叶绿体和质膜或胞间连丝互作。本研究结果为进一步揭示甘薯WRKY转录因子在胁迫响应和抗病机制中的生物学功能提供了参考依据。

• 单位
  中国检验检疫科学研究院; 西南大学