本发明公开了一种胆固醇分子探针及其制备方法,以石胆酸为原料,经酯化反应、氧化反应、脱氢反应、羰基保护反应、还原反应、羟基保护反应、还原反应、碘代反应、取代反应、脱保护反应后,得到如式(1)所示的胆固醇分子探针。本发明还公开了所述式(1)胆固醇分子探针在用于鉴定胆固醇修饰蛋白中的应用。本发明所述的胆固醇探针可以模拟正常胆固醇促进细胞生长,促进胆固醇修饰蛋白hedgehog的剪切成熟,并且可以用来研究蛋白质的胆固醇修饰。