外泌体参与调节高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化

作者：熊云峰; 王琰; 曲丽娟; 余毅^*

来源：中华肾脏病杂志, 2021, 37(05).

• 血管钙化
• 外泌体
• 微RNAs
• 高磷

目的探究外泌体在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)钙化中的调节作用。方法体外培养VSMC(A7r5细胞),随机分为正常磷组(0.9 mmol/L)、高磷组(2.6 mmol/L)及高磷外泌体诱导组(即高磷组细胞提取的外泌体加入正常培养的VSMC中)。至培养第7天,收集正常磷组、高磷组细胞培养换液过程中获得的培养液,通过超速离心法得到沉淀物,BCA蛋白定量法测定所得沉淀物蛋白含量,分别对所得沉淀物用透射电镜观察沉淀物形态及大小,Western印迹法检测外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101 protein,TSG101)、CD9;并对外泌体微RNA(microRNA,miRNA,miR)进行提取,实时定量PCR法检测miR-30b、miR-204、miR-211含量。分别培养7 d后,观察高磷外泌体诱导组VSMC对外泌体的摄取过程,观察3组细胞形态,茜素红染色检测细胞钙盐沉积水平,邻甲苯酚络合铜检测细胞钙离子含量,比色法检测细胞碱性磷酸酶含量,Western印迹法检测成骨特异性转录因子(Runx2)蛋白表达情况。结果 (1)VSMC培养液经超速离心法所获沉淀物,经电镜形态学鉴定为外泌体,Western印迹法证实外泌体标志蛋白TSG101、CD9表达阳性。(2)外泌体内富含miRNA,经测定,高磷组外泌体中负向调控Runx2转录的miR-30b、miR-204、miR-211表达较正常磷组明显下调(均P<0.05)。(3)高磷培养VSMC 7 d后,钙盐沉积明显,与正常磷组相比,钙含量、碱性磷酸酶活性明显增高(均P<0.05),Runx2表达也明显增高(P<0.05)。(4)将所得高磷组外泌体加入正常培养的VSMC中,外泌体可被VSMC摄取并成功诱导VSMC发生钙化,VSMC钙化指标及Runx2表达水平均明显增高。结论高磷诱导VSMC发生钙化,促进Runx2表达增高,其机制可能是借由VSMC释放外泌体传递细胞信号而实现。