微小RNA-6791-5p靶向磷酸呋喃酸性簇分选蛋白2抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭

作者：孙率真; 何梓芸; 裴富雍; 李炫飞; 冯茂辉^*; 姜毅楠; 程伏林

来源：中华实验外科杂志, 2023, 40(09).

• 结直肠癌
• 微小RNA
• 磷酸呋喃酸性簇分选蛋白2

目的探讨微小RNA(miR)-6791-5p对人结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响及其分子机制。方法采集培养人结直肠癌细胞系RKO、SW480、DLD1、HCT116以及人正常结肠上皮细胞NCM460。通过反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-6791-5p在各细胞系中的表达水平(表达倍数为0.52±0.04、0.83±0.06、0.60±0.12、0.68±0.07), 并构建miR-6791-5p模拟物(miR-6791-5p mimic)及其阴性对照Negative control, 并将其转染至RKO细胞。使用RT-qPCR检测miR-6791-5p和PACS2 mRNA的表达水平(表达倍数为0.468±0.032)。利用蛋白质印迹法(Western blot)检测PACS2蛋白的表达水平[RKO:(51.590±6.018)%]。使用两样本t检验进行统计分析, 结果以均数±标准差(±s)表示, 以P<0.05为差异有统计学意义。结果 miR-6791-5p在人结直肠癌细胞系表达水平显著低于人结肠上皮细胞, 其中RKO和DLD1下调最明显(RKO组低于460组:0.52±0.04比1.00、DLD1组低于460组0.60±0.12比1.00), 差异有统计学意义(RKO:t=17.811, P<0.0001;DLD1:t=5.372, P<0.01)。RKO转染后, mimic组miR-6791-5p表达水平高于mimic NC组(3.28±0.44比1.00), 差异有统计学意义(RKO:t=8.764, P<0.01)。细胞计数试剂(CCK-8)检测表明mimic组24、48、72、96 h细胞吸光度值显著低于mimic NC组(24 h吸光度值为0.185±0.004比0.250±0.030, 48 h吸光度值为0.275±0.040比0.376±0.020, 72 h吸光度值为0.497±0.120比0.657±0.010, 96 h吸光度值为0.691±0.004比0.905±0.019), 差异有统计学意义(RKO:t=10.821, P<0.01)。平板克隆实验表明mimic组集落形成数低于mimic NC组(115.70±12.51比176.00±19.18), 差异有统计学意义(RKO:t=4.581, P<0.05)。划痕愈合实验显示miR-6791-5p mimic组划痕愈合率低于NC组[(14.960±0.848)%比(36.480±1.340)%], 差异有统计学意义(t=23.491, P<0.0001)。Transwell迁徙和侵袭实验显示穿透微孔膜的细胞数mimic组低于mimic NC组(迁移数目miR-6791-5p mimic组比NC组42.330±3.512比125.700±7.760, 侵袭数目分别为54.33±4.16比159.30±7.76), 差异有统计学意义(Transwell迁移t=16.931, P<0.01)、(Transwell侵袭t=20.641, P<0.01)。在线靶预测软件(miRWalk、mirtarbase、targetscan)预测miR-6791-5p可能的靶基因, 并通过qRT-PCR及Western blot验证, mimic组PACS2的mRNA及蛋白表达水平低于mimic NC组[比例为(51.590±6.018)%比1.00], 差异有统计学意义[mRNA(RKO:t=27.951, P<0.0001);Western blot(RKO:t=13.931, P<0.001)]。结论 miR-6791-5p在结直肠癌细胞中低表达, 过表达miR-6791-5p能抑制结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力, 并且明显下调PACS2的mRNA和蛋白表达水平, 说明miR-6791-5p可能通过PACS2调控结直肠癌增殖、迁移及侵袭能力。

• 单位
  武汉大学中南医院