利用Crispr/Cas9基因编辑系统在人胚胎干细胞中探索ELABELA的潜在新受体

作者：周月; 程晨; 郑恩霖; 孟卓; 王鉴; 王青洁; **宁; 孙锟^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2022, 42(09): 1258-1264.

DOI：10.3969/j.issn.1674-8115.2022.09.012

• 人胚胎干细胞
• ELABELA
• APJ
• 基因编辑

目的·利用Crispr/Cas9基因编辑技术在人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）中探索小分子多肽ELABELA (ELA)是否存在潜在的新受体。方法·收集干细胞向心肌细胞定向分化过程中不同天数（0～13 d）的细胞，检测其ELA及其受体APJ的动态表达水平。在干细胞向心肌细胞定向分化过程中加入APJ抑制剂ML221，观察心肌细胞标志物MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平是否发生变化。利用人胚肾悬浮细胞（HEK-293F）表达重组ELA绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP），研究ELA发挥结合作用的区域在其C末端还是N末端，构建GFP序列分别插入ELA-32序列的C末端及N末端的2种重组质粒。利用Crispr/Cas 9基因编辑技术构建ELA唯一已知受体APJ敲除的hESC并进行验证。在构建成功的敲除细胞系及正常细胞系中外源性加入2种GFP-ELA重组蛋白，通过荧光显微镜观察ELA是否能够进入细胞。结果·在干细胞向心肌细胞定向分化过程中，在干细胞时期，ELA高表达而APJ低表达；ELA表达高峰在分化第6天而APJ表达高峰出现在分化第3天。外源性加入APJ抑制剂ML221后，MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平无显著变化（P>0.05）。经过基因DNA测序及Western blotting验证，成功构建敲除APJ干细胞系。敲除APJ后，外源性加入ELA N端荧光蛋白，仍能够进入细胞内；而ELA C端荧光蛋白未出现荧光，表示ELA C端荧光蛋白不能进入细胞。结论·hESC中存在非APJ的ELA其他受体，ELA与受体发生结合的部位主要位于C末端。

• 单位
  上海交通大学医学院附属仁济医院; 上海交通大学医学院附属新华医院; 上海市肿瘤研究所