CRISPR/Cas9技术介导Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞系的构建及其三维视网膜类器官培养

作者：杜雨馨; 刘依宗; 阎飞跃; 沈吟^*

来源：中华实验眼科杂志, 2021, 39(05).

• 视网膜类器官
• 3D培养
• 胚胎干细胞
• 光感受器前体细胞

目的利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后, 利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测, 根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后, 将打靶载体电转H9细胞系, 在hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2, 进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序, 根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系, 通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例, 采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官, 于分化后不同时间点行冰冻切片, 免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。结果 H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA, 最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆, 其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%, 所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确, 正常表达干细胞标志物, 核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d, 出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞, 分化后45 d, 出现RECOVERIN阳性光感受器细胞, 分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层, 水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层, 光感受器细胞主要分布于顶层。结论成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系, 该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致, 且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具, 可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究, 并促进致盲疾病治疗方法的开发。

• 单位
  武汉大学; 武汉大学人民医院