摘要

为了研究猪链球菌 2 型(SS2)05ZYH33 菌株高甘露糖型 N-聚糖水解酶的结构域及功能,本研究通过BLAST 检索,发现该菌株中存在分别与肺炎链球菌高甘露糖型 N-聚糖水解酶 SpGH92 和 EndoD 同源的蛋白,分别为 SSU05_1921(后简写为 1921)和 SSU05_1922(后简写为 1922)。本研究通过原核表达系统和 Ni-NTA 柱亲和层析纯化,获得了 1921 和 1922 全长蛋白,以及 1922 蛋白的糖苷水解酶结构域 1922-Cat。通过 6 个蛋白反应(不加蛋白的阴性对照、分别仅加 1921 和 1922 的蛋白反应 2、3,同时加入 1921 和 1922 的蛋白反应 4、5 及同时加入 1921 和1922-Cat 的蛋白反应 6) 的 RNase B 去糖基化试验,反应结束后分别通过 SDS-PAGE 及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析 RNase B 的水解(即去糖基化)产物,研究 1921 和 1922 水解高甘露糖型 N-聚糖的功能。结果显示,1921 为外切 α-1,2-甘露糖苷酶,水解 RNase B 高甘露糖型 N-聚糖末端的 α-1,2-甘露糖苷键;1922 为内切 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,水解 RNase B 高甘露糖型 N-聚糖中的几丁二糖,作用位点为 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷键。且只有在 1921 去除所有的 α-1,2-甘露糖苷键,1922 才能彻底水解高甘露糖型 N-聚糖。二者的联合作用(反应 4)结果显示,在 15 ku 处出现单一条带,表明二者联合作用于 RNase B 的高甘露糖型 N-聚糖后,将其彻底去糖基化为 R-GlcNAc,且 1921 与 1922-Cat 的联合作用与上述联合作用结果一致,表明 1922 的主要催化结构域即为 1922-Cat。因此选择 1921 与 1922-Cat 联合作用于 RNase B 的去糖基化反应研究不同 pH、不同金属离子及 EDTA 和 EGTA 螯合物对该联合作用的影响。结果显示,该联合作用的最适 pH 为 7.0~8.0,二价金属离子Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+、Zn2+均明显抑制 1921 与 1922-Cat 的联合作用,Ca2+部分抑制该联合作用,而二价离子Mg2+、Mn2+和一价离子 K+、Na+及二价金属离子螯合物 EDTA 和 EGTA 对该联合作用无明显抑制作用,表明 1921 和1922-Cat 的联合作用不依赖于二价金属离子。本研究首次较详细探究了 SS2 高甘露糖型 N-聚糖水解酶的功能和生化特性,为解析 SS 定植和感染过程中糖类营养物质获取的机制奠定了基础。