猪链球菌2型05ZYH33糖苷水解酶SSU05＿1921和SSU05＿1922的表达纯化及功能研究

作者：卫东; 高广娟; 武柳君; 朱金鲁; 刘思国; 刘冉^*; 张跃灵^*

来源：中国预防兽医学报, 2022, 44(03): 269-276.

• 猪链球菌2型05ZYH33
• SSU05＿1921
• SSU05＿1922
• 糖苷水解酶
• 高甘露糖型N-聚糖

为了研究猪链球菌 2 型(SS2)05ZYH33 菌株高甘露糖型 N-聚糖水解酶的结构域及功能，本研究通过BLAST 检索，发现该菌株中存在分别与肺炎链球菌高甘露糖型 N-聚糖水解酶 SpGH92 和 EndoD 同源的蛋白，分别为 SSU05＿1921(后简写为 1921)和 SSU05＿1922(后简写为 1922)。本研究通过原核表达系统和 Ni-NTA 柱亲和层析纯化，获得了 1921 和 1922 全长蛋白，以及 1922 蛋白的糖苷水解酶结构域 1922-Cat。通过 6 个蛋白反应(不加蛋白的阴性对照、分别仅加 1921 和 1922 的蛋白反应 2、3，同时加入 1921 和 1922 的蛋白反应 4、5 及同时加入 1921 和1922-Cat 的蛋白反应 6) 的 RNase B 去糖基化试验，反应结束后分别通过 SDS-PAGE 及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析 RNase B 的水解(即去糖基化)产物，研究 1921 和 1922 水解高甘露糖型 N-聚糖的功能。结果显示，1921 为外切 α-1,2-甘露糖苷酶，水解 RNase B 高甘露糖型 N-聚糖末端的 α-1,2-甘露糖苷键；1922 为内切 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，水解 RNase B 高甘露糖型 N-聚糖中的几丁二糖，作用位点为 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷键。且只有在 1921 去除所有的 α-1,2-甘露糖苷键，1922 才能彻底水解高甘露糖型 N-聚糖。二者的联合作用(反应 4)结果显示，在 15 ku 处出现单一条带，表明二者联合作用于 RNase B 的高甘露糖型 N-聚糖后，将其彻底去糖基化为 R-GlcNAc，且 1921 与 1922-Cat 的联合作用与上述联合作用结果一致，表明 1922 的主要催化结构域即为 1922-Cat。因此选择 1921 与 1922-Cat 联合作用于 RNase B 的去糖基化反应研究不同 pH、不同金属离子及 EDTA 和 EGTA 螯合物对该联合作用的影响。结果显示，该联合作用的最适 pH 为 7.0～8.0，二价金属离子Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+、Zn2+均明显抑制 1921 与 1922-Cat 的联合作用，Ca2+部分抑制该联合作用，而二价离子Mg2+、Mn2+和一价离子 K+、Na+及二价金属离子螯合物 EDTA 和 EGTA 对该联合作用无明显抑制作用，表明 1921 和1922-Cat 的联合作用不依赖于二价金属离子。本研究首次较详细探究了 SS2 高甘露糖型 N-聚糖水解酶的功能和生化特性，为解析 SS 定植和感染过程中糖类营养物质获取的机制奠定了基础。

• 单位
  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所; 兽医生物技术国家重点实验室