科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的观察重组入神经调节蛋白(recombinant neuregulin-1beta,rhNRG)-1β在氧和葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)条件下通过细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路对小鼠神经干细胞增殖能力的影响。方法将怀孕1417 d的小鼠处死,分离脑室管膜下区的脑组织,提取神经干细胞。采用体外细胞培养方法进行细胞传代和鉴定。神经干细胞鉴定采用SABC-FITC(POD)双标试剂盒,标记免疫荧光细胞化学法镜下检测巢蛋白(Nestin)表达。空白对照组:取鉴定后的神经干细胞,细胞数为2×1 0+个,放入24孔培养板中,DMEM/F12完全培养液培养3 h;OGD组:取鉴定后神经干细胞,细胞数为2×10+个,放入24孔培养板中,加入不含葡萄糖的DMEM/F12培养液,将培养板移入潮湿密闭容器内(37℃恒温培养),容器内含有氮气(950ml/L)和氧气(50 ml/L)的混合气体,缺糖缺氧培养1 h后,再更换完全培养液培养3 h;OGD+rhNRG-1β组:在OGD干预前先加入100μg/L rhNRG-1β,再培养3 h。神经球形成:分别取3组干细胞,反复吹打成单细胞,按细胞个数1×106/ml将神经干细胞接种到含多聚赖氨酸盖玻片上的培养板中,培养7 d后取出盖玻片,相差镜下观察3组干细胞神经球形成,计算神经干细胞增殖变化;克隆形成:分别取3组干细胞,接种于60 mm培养皿中,细胞个数2×10+个,完全培养液培养24 h,相差镜下观察3组细胞克隆形成,计算神经干细胞增殖变化;蛋白免疫印迹法(Western blot):测定3组干细胞磷酸化ERK(pERK)蛋白的变化,观察rhNRG-1β通过ERK信号通路上调pERK蛋白表达对小鼠神经干细胞增殖能力的影响。结果镜下原代培养的神经干细胞呈单个或成对生长,形态呈圆形;神经干细胞增殖呈团状集落;可见带有黄绿色荧光的特异性Nestin蛋白标记的神经干细胞。神经干细胞神经球数量、平均直径组间比较差异有统计学意义(F=693.66、1 002.09,P均<0.01),其中OGD组神经干细胞神经球形成受到显著抑制,形成数量、平均直径[(88.78±7.14)个、(62.12±2.52)μm]明显低于对照组[(246.34±8.67)个、(128.45±2.33)μm]和OGD+rh-NRG-1β组[(237.87±6.61)个、(118.37±2.71)μm,P均<0.01]。神经干细胞克隆形成率组间比较差异有统计学意义(F=132.03,P<0.01),其中OGD组神经干细胞克隆形成受到显著抑制,形成率[(11.65±0.94)%]明显低于对照组[(33.23±2.93)%]和OGD+rh-NRG-1β组[(31.42±2.61)%,P均<0.01]。Western blot显示,神经干细胞pERK蛋白表达组间比较差异有统计学意义(F=63.76,P<0.01),其中OGD组pERK蛋白的相对表达量(0.487±0.072)明显低于对照组(1.013±0.112)和OGD+rh-NRG-1β组(1.752±0.278,P均<0.01)。结论在OGD条件下,pERK蛋白表达下降,小鼠神经干细胞增殖受到抑制;rhNRG-1β能上调pERK蛋白表达,促进小鼠神经干细胞的增殖。小鼠神经干细胞的增殖能力受ERK信号通路的影响。
-
单位神经内科; 哈尔滨医科大学附属第二医院
