双退火温度PCR扩增DNA

作者：黄亚威; 杨昂; 上官云杰; 贺添艳; 徐文选; 刘亮伟

来源：微生物学报, 2017, 57(08): 1262-1269.

DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.20170013

• 双退火温度
• PCR
• DNA

【目的】与设置单一退火温度的常规PCR(S-Tm PCR)不同,本研究探讨双退火温度PCR(D-Tm PCR)由高到低设置2条引物各自退火温度。【方法】以PxF61和VPel为正/反向引物,用Q5 DNA聚合酶扩增4.3 kb的模式DNA pET20b-Xyn(黑曲霉木聚糖酶基因)。PCR程序为:98°C预变性3 min,30次循环{98°C变性30 s,设置双退火[Tm1 70°C(Px F61)退火15 s、Tm2 62°C(VPel)退火15 s],72°C延伸130 s}。【结果】与S-Tm PCR(61°C)相比,D-Tm PCR扩增4.3 kb的目的条带亮度更高,减少2条杂带;经25次循环目的 DNA产物量最高。D-Tm PCR用于长片段引物扩增5.3 kb重组质粒DNA条带更明显。【结论】D-Tm PCR直接扩增目的条带,避免了探讨Tm的麻烦,不要求2条引物Tm相近,从理论上更加清晰地认识引物与各自模板分步退火过程。

• 单位
  农业部; 河南农业大学; 生命科学学院