利用反向遗传技术制备重组人类偏肺病毒

作者：张金辉; 葛金英; 任妍; 步志高; 赵晓东

来源：微生物学通报, 2009, (08): 1239-1243.

• 反向遗传技术
• 人偏肺病毒
• 病毒拯救

利用反向遗传技术,将包含人偏肺病毒2个血清型A和B代表株NL/1/00和NL/1/99全基因组cDNA的质粒及其4种辅助蛋白N、P、L、M2.1的表达质粒pCITE-N、pCITE-L、pCITE-P、pCITE-M2.1分别共转染BSR-T7细胞以制备重组hMPV。3μg全长cDNA质粒,辅助蛋白质粒pCITE-N、pCITE-L、pCITE-P、pCITE-M2.1分别为0.3μg、0.15μg、0.3μg和0.24μg,通过Lipofectamine2000转染BSR-T7细胞,转染后3天,将BSR-T7细胞于?80°C冻融一个循环以裂解细胞,取上清液感染VeroE6细胞。接种后的VeroE6细胞,6天细胞可观察到明显的细胞病变效应;RT-PCR检测出符合预期目标大小的450bp条带;间接免疫荧光实验检测感染后的VeroE6细胞可在荧光显微镜下可观察到特异性绿色荧光,结果一致表明全基因组cDNA及其辅助质粒产生了有感染性的重组hMPV病毒。用细胞病变法和测试重组病毒的病毒滴度和生长曲线,重组病毒6天时A型代表株NL/1/00在VeroE6细胞滴度为106.4TCID50/mL,B型代表株NL/1/99为105.33TCID50/mL。

• 单位
  重庆医科大学附属儿童医院; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所