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摘要
目的构建携带野生型Rheb(WT)和Rheb突变体(持续活化型Q64L和显性失活型D60K)重组腺病毒载体,验证其携带的Rheb WT和Rheb突变基因在MCF-7细胞中的表达情况及其对血清饥饿的乳腺癌细胞MDAMB-231增殖的影响。方法采用细胞内同源重组法构建携带Rheb和Rheb突变体的重组腺病毒载体pacAd5CMV-Rheb,PCR法检测病毒上清;将病毒上清感染MCF-7细胞后Western blotting(WB)检测Rheb及下游产物表达。将重组腺病毒感染血清饥饿的乳腺癌细胞MDA-MB-231并观察细胞增殖情况。结果酶切、测序及PCR表明构建的重组腺病毒载体携带Rheb和Rheb突变基因。重组腺病毒体外感染MCF-7细胞,WB检测到腺病毒感染的MCF-7细胞内Rheb蛋白表达较对照组明显增高,S6及β-actin蛋白的表达在各组间没有统计学差异。转染Rheb WT和Q64L组MCF-7细胞的P-S6表达较对照组和D60K组显著增高。无血清培养条件下,感染Rheb Q64L组的乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖能力较对照组及WT组强,而转染D60K组则较其他三组(EGFP、WT和Q64L组)的细胞增殖明显减弱。结论成功构建野生型Rheb和Rheb突变体重组腺病毒质粒,为体内外进一步研究Rheb基因对乳腺癌的作用奠定了基础。
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