外源HCV核心基因表达载体在HepG2中蛋白表达的亚细胞定位

作者：张志培; 王小平; 徐鉷; 朱以芳; 陈德凤; 王文勇; 黄立军; 程庆书

来源：胃肠病学和肝病学杂志, 2007, (01): 46-50.

• 丙型肝炎,HCV
• 核心蛋白,C蛋白
• 亚细胞定位
• HepG2

目的研究HCV全长(天然)核心蛋白(C蛋白)和成熟C蛋白在HepG2细胞内的亚细胞定位,为进一步研究C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用提供实验依据。方法设计HCV全长和成熟核心基因引物,以pBRTM/HCV1-3011为真核表达载体为模版行PCR;将PCR扩增产物酶切纯化后定向插入pEGFP-C1的BeglⅡ和EcoRⅠ位点,得到能表达全长HCV核心蛋白(C191aa.)和成熟核心蛋白(C173aa.)的真核表达载体pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173;将扩增pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173质粒转染到HepG2细胞中,28h、5d在荧光显微镜下观察两种C蛋白的亚细胞定位。5d后再用免疫细胞化学法观察两种C蛋白在HepG2细胞中着色现象。结果HCV核心基因PCR产物和构建的pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173经扩增测序证实。pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞28h后融合荧光全长C蛋白C191主要出现在核膜和胞质中,少部分出现在胞核及其膜中;而pEGDP-C1-C173转染HepG2细胞28h后主要定位在核中和核膜上。但pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞5d后,其表达的融合荧光蛋白主要出现在核内和核膜上,少量在胞质中;而成熟C蛋白C173则仍然在胞核内及核膜上。pEGDP-C1-C转染HepG2细胞5d后进行免疫细胞化学显示,C191蛋白和C173蛋白主要在核中、核膜着色,胞质有少量着色。结论HCV全长C蛋白的亚细胞定位是一动态过程,先出现在胞质中和核膜上,最后定位在核中和核膜上;成熟C蛋白主要定位在核中和核膜上。这种现象为解释瞬时转染HCV不同长度C基因对p53/p21通路作用出现相反结果奠定基础。

• 单位
  中国人民解放军空军军医大学