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摘要
来源于肠膜状明串株菌0326的右旋糖酐蔗糖酶（DSR,EC2.4.5.1）是葡聚糖蔗糖酶的一种,能够催化蔗糖产生右旋糖酐（Dextran）,因其具有安全、无毒、生物相容性等多种优点,被广泛应用于食品和医药等行业中。本研究拟通过插入氨基酸以改变产物键型提高枝化度,定点突变及引入二硫键提高该酶的热稳定性。本实验室前期己成功构建出右旋糖酐蔗糖酶基因（dexYG）与载体pET-28a连接的重组质粒,并在E.ColiBL 21中成功表达。在前期研究的基础上,以构建的重组质粒为模板,通过对活性口袋结构及受体相互作用的分析,选择了距离受体分子较近的553位和662位氨基酸,并采用同源重组法对氨基酸进行插入,成功构建17个活性突变体。通过核磁手段（NMR）分析产物键型,出现了新的α（1-4）键,且比例由0变化为11.2%,最高甚至达到了53.6%,说明产物的枝化度提高。同时通过定点突变引入丝氨酸（Ser）、赖氨酸（Thr）以提高该酶的热稳定性,在该酶的不同结构域上共选择了Pro-473,Pro-678,Pro-856,Lys-378,Lys-725,Lys-955六个单点,通过双、三点突变共构建了14个突变体,P473S/P856S酶活性与野生型相比提高了2.86倍。考察了其最适反应温度、35℃及45℃下的热保留活性及对热稳定性的贡献,当野生型己完全失活时,该突变酶仍保有一定的活性,一定程度上提高了重组右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性。空间结构模拟分析发现分子间氢键的作用是引起热稳定性改变的一个重要因素。二硫键是由两个半胱氨酸（Cys）之间形成的共价键,它的形成对于稳定蛋白质的空间结构和保持其活性功能具有极其重要的影响。在此基础上,通过Disulfide by DesignTM分析得到潜在的98对二硫键,以P473S/P856S为模板定点突变初步引入二硫键,二次PCR反应后分别构建六对二硫键。在EColiBL 21中成功表达并考察其酶活性,只有D739C-F932C具有一定酶活,研究其热稳定性发现并没有提高反而有所降低,其产物糖苷键比例反生了明显的变化（α（1-4）键由0增加到15.8%）,说明突变酶催化活性被改变,二硫键可能并没有正确的形成而只是突变正确。可能因为该酶的序列较长,没有解析的晶体结构,因此引入二硫键有一定难度。本研究对提高右旋糖酐枝化度及重组右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性提供了方法与基础。通过随机突变可发现目前酶三维结构中未被发现的热点区域,也是获得耐热性和低水解酶的有效方法。通过理性设计及结构指导合成特定的α-葡聚糖,新型右旋糖酐将被更好应用于食品与医药产业。
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